烟草具有较高的经济价值，是我国重要的经济作物，受耕地资源短缺、经济利益驱使等多方面原因影响，目前连作及化肥滥用成为烟草行业普遍现象，而这些是导致烟田土壤条件恶化的主要原因[1-3]。研究表明，烟草的生长、发育及产量与品质的形成与土壤的理化特性和肥力水平息息相关，适宜的土壤条件是形成优质适产烟叶的重要基础[4]。合理施用有机肥，适当减少化肥施用可以有效改善土壤的理化性状，如降低土壤容重，提升耕性和有机质及速效养分含量、提高土壤生物学活性，同时施用适宜有机肥也可以改善烤烟烟叶的外观质量、化学成分协调性和感官质量等[5-8]。合理施用有机肥、有机肥替代部分化肥，也是实现中国2020年化肥零增长目标的重要途径之一。
目前，关于有机肥替代化肥的研究较多集中在水稻、玉米和小麦[9-13]，对烟草的研究也有报道[14-15]，但对陕南地区烟草鲜有报道，尤其是以蚯蚓粪肥氮替代化肥。蚯蚓粪是有机废弃物经蚯蚓处理后形成的一种富含有益微生物，同时具有良好的孔隙性与通气性的黑色细碎颗粒物，对改良土壤理化特性促进植物生长及品质改善具有一定作用[16]。目前，蚯蚓粪生物有机肥料，主要运用于蔬菜、谷物、豆科植物及花卉种植中效果明显，而在烟草中研究尚处于初期，但效果较好[17-18]。毕明飞[19]研究表明，蚯蚓粪替代部分现有育苗基质对烟苗主根与侧根长度、根系活力、碳氮代谢关键酶活力有显著促进作用。李晓娜[17]对不同饵料的蚯蚓粪肥研究表明，蚯蚓粪肥可显著提高土壤酶活性及速效养分含量。赵鹏博等[20]研究表明，较CK处理配施蚯蚓粪的处理能显著降低土壤容重，增加速效养分及有机质含量。李锐等[21]研究表明，蚯蚓粪肥对烤烟碳代谢具有一定的促进作用，同时对烤烟氮的分配导向具有一定的影响，能有效降低氮向烟碱方向的合成与积累，进而改善烟叶品质。毛凯伦等[22]研究表明，施用蚯蚓粪处理圆顶期及成熟期烟叶氮、钾及还原糖含量较CK处理显著的增加，烤后烟叶化学成分更加协调。
本研究旨在以蚯蚓粪肥氮替代部分化肥氮研究其对植烟土壤理化及生物学肥力因子的影响，同时采用简单相关性分析及主成分分析以探讨蚯蚓粪肥部分替代化肥情况下各肥力因子的关系，探寻蚯蚓粪肥替代化肥影响土壤肥力的关键因子，并评价其改良效果。为合理施用蚯蚓粪肥改良植烟土壤，实现化肥减施增效改善生态环境，促进烟草行业可持续发展提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验地概况
试验地位于陕西省商洛市洛南县永丰镇李洼村(N 34°05′，E 110°01′)，地处中国南北气候分界线秦岭东段，属暖温带季风性半湿润气候，年平均气温11.1 ℃，夏季平均气温21.8 ℃，年降水量760 mm。供试烟田规整平坦，土壤类型为黄棕壤土。耕层土壤基本理化性状为：pH值5.83，有机质9.55 g/kg，碱解氮20.20 mg/kg，速效磷(P)28.50 mg/kg，速效钾(K)157.40 mg/kg。
1.2 试验品种与设计
试验时间为2017年4-9月，供试品种为云烟99。试验设5个处理(表1)，除CK处理不施肥，其余各处理施氮量一致，按当地常规氮用量(97.5 kg/hm2)。各处理设置4次重复，小区随机排列，每小区6行，每行20株，行距1.20 m，株距0.50 m，小区面积68.4 m2。各处理肥料做基肥混匀后采用开沟条施，一次全部施用不追肥，其他管理按当地优质烤烟种植规范进行。选用的烟草专用肥养分含量为N∶P2O5∶K2O=10∶10∶20，蚯蚓粪由陕西康运生物科技有限公司生产，养分含量为：N 13.5 g/kg、P2O5 10.9 g/kg、K2O 12.9 g/kg。烤烟移栽期为5月2日，顶叶成熟时间为9月9日。
表1 试验设计
Tab.1 Experiment design
处理Treatment试验设计Experiment designCK长期无肥区T1纯化肥区(总施氮量97.5 kg/hm2)T2蚯蚓粪肥氮替代30%化肥氮(总施氮量97.5 kg/hm2)T3蚯蚓粪肥氮替代50%化肥氮(总施氮量97.5 kg/hm2)T4蚯蚓粪肥氮替代70%化肥氮(总施氮量97.5 kg/hm2)
1.3 样品采集
分别于团棵期、旺长期、圆顶期、成熟期，采用五点采样法采集各小区烟垄上2株烟正中位置0～20 cm耕层土壤1 kg，自然风干后，剔除肥料等杂物，过筛后用于土壤养分及酶活测定。同时，每个处理选取3株烟，挖出烟株根系并除去根围附近较大的土壤团块，小心抖动并收集黏附在烟株根表面
0～4 mm的土壤，用无菌袋包装，带回实验室后，4 ℃冰箱保存用于根际土壤微生物测定。
1.4 测定项目与方法
土壤容重采用环刀法测定、pH采用电位计法(水土比10∶1)测定，碱解氮采用碱解扩散法、速效磷采用NaHCO3浸提钼锑抗比色法、速效钾采用NH4OAc浸提火焰光度法、有机质采用重铬酸钾容量法[23]，土壤脲酶采用比色法，酸性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法，过氧化氢酶采用 KMnO4滴定法，蔗糖酶采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定[24]。土壤微生物数量采用稀释平板计数法[25]测定，细菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、真菌采用孟加拉红琼脂培养基、放线菌采用高氏一号琼脂培养基。
1.5 数据统计分析
各肥力指标数据为4个生育期平均值，原始数据经Excel 2010软件初步整理后，采用SPSS 20.0软件先进行单因素方差分析与Duncans多重比较，再进行简单相关性分析，接着对原始数据标准化后进行主成分分析及评价。
2 结果与分析
2.1 蚯蚓粪肥氮替代化肥氮对土壤理化特性的影响
由表2可以看出，施肥对土壤理化特性有影响，且强弱与肥料种类及比例有关；不施肥或配施蚯蚓粪肥能显著降低土壤容重，较纯化肥处理(T1)，无肥处理CK土壤容重降低2.38%，配施蚯蚓粪肥处理(T2、T3及T4)土壤容重降幅达3.17%～6.35%，这表明纯施化肥增加土壤容重，而配施蚯蚓粪肥或不施肥能有效降低土壤容重；与CK相比各处理pH降低，而化肥与蚯蚓粪肥配施处理较T1下降幅度较小；施肥能显著增加土壤速效养分及有机质含量，其中土壤碱解氮、速效磷及速效钾含量以T2处理最高，较CK分别增加2.63，1.38，0.99倍；有机质含量表现为随蚯蚓粪比例增加而呈递增的趋势，T4处理含量最高达22.35 g/kg，较CK处理增加62.07%，T1增幅最小为8.48%。这表明，施肥能有效改善土壤理化特性，一定比例蚯蚓粪肥替代化肥较纯施化肥具有更显著的效果。
表2 蚯蚓粪肥替代化肥对土壤理化特性的影响
Tab.2 Effect of earthworm manure instead of chemical fertilizers on soil physical and chemical properties
处理土壤容重/(g/cm3)Soil bulk densitypH碱解氮/(mg/kg)Alkali-N速效磷/(m/kg)Olsen-P速效钾/(mg/kg)Avail-K有机质/(g/kg)Organic matterCK1.23b5.67a16.82e30.85d139.30e13.79eT11.26a5.12e55.05b66.73b260.93c14.96dT21.22b5.25d60.99a73.29a277.47a18.77cT31.21b5.49b50.19c66.53b239.47d19.99bT41.18c5.46c49.00d63.02c269.40b22.35a
注：同一列不同字母表示差异达到5%显著水平，表3同。
Note：Different letter in the same column indicate significant differences among the mean values at P < 0.05，the same as Tab.3.
2.2 蚯蚓粪肥氮替代化肥氮对土壤生物学特性的影响
土壤微生物及土壤酶是土壤的重要组成部分，它们参与土壤氮磷钾等养分的固持和转化，对土壤肥力的形成和植物营养转化起着积极的作用，对环境的等外界因素引起的变化较敏感，在一定程度上反映了土壤所处的状况，常作为土壤生态系统变化的预警和敏感指标[26-28]。由表3可知，施肥种类及配比对各土壤酶活及微生物数量有不同程度的影响。总体而言，除T1处理脲酶、蔗糖酶及过氧化氢酶活性与CK相当或略低，其余处理各指标较CK均有显著提升且蚯蚓粪肥替代处理微生物数量及酶活性显著高于纯化肥处理(T1)，较T1处理蚯蚓粪肥替代处理脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶分别增加16.45%～37.97%，22.99%～34.57%，18.40%～28.80%，10.19%～19.74%，而细菌数量增加43.22%～122.35%，真菌数量增加20.74%～55.87%、放线菌数量增加44.80%～76.64%；除过氧化氢酶活性、细菌及真菌数量随蚯蚓粪肥替代比例增加呈递增趋势其余各指标无明显规律，各处理土壤生物学特性以T4处理综合表现较好。这表明施肥特别是配施一定比例的蚯蚓粪肥对土壤生物学特性有显著促进作用。
表3 蚯蚓粪肥替代化肥对土壤生物学特性的影响
Tab.3 Effect of earthworm manure instead of chemical fertilizers on soil biological properties
处理Treatment脲酶/(mg/(g.d))Urease蔗糖酶/(mg/(g.d))Invertase酸性磷酸酶/(mg/(g.d))Acid phosphatase过氧化氢酶/(mL/(g.h))Catalase细菌数量/(×105 cfu/g)The numberof bacteria真菌数量/(×103 cfu/g)The numberof fungi放线菌数量/(×104 cfu/g)The number of actinomyceteCK0.79d6.51c1.14e1.69d17.41e7.49e8.05dT10.79d6.48c1.25d1.57e29.24d11.67d10.96cT20.96b8.07b1.52b1.73c41.88c14.09c16.39bT30.92c7.97b1.61 a1.81b49.72b16.73b15.87bT41.09a8.72a1.48c1.88a64.43a18.19a19.36a
2.3 土壤肥力指标相关性分析
影响土壤综合肥力的因子众多，各肥力因子存在着一定的相关性关系，当2个变量之间有一定相关关系时，表明这2个变量所指代的肥力信息有一定程度的重叠，为了更好筛选出蚯蚓粪肥替代化肥影响土壤肥力的关键因子群，综合评价土壤的肥力水平，因此有必要深入研究影响土壤综合肥力各主要因子的内在联系。
2.3.1 简单相关性分析 由表4可知，同一类别的不同肥力因子之间以及不同类别的肥力因子之间确实存在一定的相关关系，虽然部分肥力因子间的相关性不显著，但是绝大多数肥力因子间相关性达到显著水平甚至极显著水平，这表明各数据反映的信息存在一定程度的重叠，若直接用这些数据评价土壤综合肥力，必然会影响评价结果的客观性。为进一步探索各因子与土壤综合肥力的关系，从复杂的土壤因子中提炼出影响土壤综合肥力的主要因子群，有必要通过主成分分析运用降维的思维精简各肥力因子，以便对土壤综合肥力进行深入分析与评价。
2.3.2 主成分分析 主成分分析是一种运用降维思维的统计方法，它可以将原来较多且重叠的变量重新组合成一组新的相互无关的几个综合变量，同时根据实际需要从中可以取出几个较少的总和变量尽可能多地反映原来变量的信息[29]。
根据主成分分析原理，当主成分的累积方差贡献率大于85%时，即可用于近似反映原始数据的信息量，由表5可知，前2个主成分的累积方差贡献率为95.045%(大于85%)，因此，前2个主成分基本能反映原始数据的信息量，其中，第一主成分的方差贡献率达69.355%，占主导地位，第二主成分的方差贡献率达25.690%。用F1、F2分别代表第一主成分、第二主成分，X1～X13分别代表经标准化后的13个土壤肥力因子，各指标前的系数为指标对应特征向量除以主成分相对应特征值的算术平方根，可得各主成分用线性函数：
F1=-0.222X1-0.060X2+0.226X3+0.242X4+0.257X5+0.325X6+0.319X7+0.251X8+0.297X9+0.308X10+0.324X11+0.322X12+0.330X13；
F2=0.368X1-0.526X2+0.398X3+0.370X4+0.338X5-0.101X6-0.129X7-0.354X8+0.038X9-0.142X10-0.063X11+0.014X12-0.014X13。
式中：X1代表土壤容重，X2代表pH，X3代表碱解氮，X4代表速效磷，X5代表速效钾，X6代表有机质，X7代表蔗糖酶，X8代表过氧化氢酶，X9代表酸性磷酸酶，X10代表脲酶，X11代表细菌，X12代表真菌，X13代表放线菌。
式中各肥力因子前系数的绝对值可理解各因子对土壤综合肥力的贡献程度，第一主成分中放线菌、有机质、细菌、真菌、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶系数绝对值相对较大，对第一主成分有较大的影响，表示微生物及土壤酶参与有机质的降解能力。第二主成分中pH、碱解氮、速效磷、土壤容重、过氧化氢酶、速效钾有较大的系数，对第二主成分有较大的影响，表示土壤速效养分的供给状况。
以每个主成分所对应的特征值方差的贡献率建立评价综合模型，即F=(69.355F1 +25.690F2)/ 95.045即可得到主成分综合模型：
F=-0.067X1-0.188X2+0.269X3+0.281X4+0.281X5+0.210X6+0.199X7+0.087X8+0.217X9+0.192X10+0.220X11+0.237X12+0.238X13。
式中：X1代表土壤容重，X2代表pH，X3代表碱解氮，X4代表速效磷，X5代表速效钾，X6代表有机质，X7代表蔗糖酶，X8代表过氧化氢酶，X9代表酸性磷酸酶，X10代表脲酶，X11代表细菌，X12代表真菌，X13代表放线菌。
综合模型中，每个指标所对应的系数即每个指标的权重，根据各指标所占权重的大小，即可看出施肥处理土壤综合肥力各指标的重要性。权重值越大，重要性越强，该模型权重系数绝对值的平均值为0.206，即X5、X4、X3、X12、X13、X9、X11、X6重要性均高于平均值。因此，这13个测定指标中最能反映各处理土壤综合肥力差别的指标依次为：速效钾、速效磷、碱解氮、放线菌、真菌、酸性磷酸酶、细菌、有机质。
表4 土壤主要理化特性的简单相关性分析
Tab.4 Simple correlation analysis of soil physical and chemical characteristics
指标Item土壤容重Soil bulkdensitypH碱解氮Alkali-N速效磷Olsen-P速效钾Avail-K有机质Organicmatter蔗糖酶Invertase过氧化氢酶Catalase酸性磷酸酶Acid phosphatase脲酶Urease细菌Bacteria真菌Fungus放线菌Actinomycetes土壤容重Soil1-0.4850.020-0.025-0.133-0.749**-0.811**-0.924**-0.490-0.822**-0.717**-0.579*-0.684** bulk densitypH-0.4851-0.818**-0.761**-0.761**0.0090.0470.498-0.1440.037-0.070-0.174-0.160碱解氮0.020-0.818**10.994**0.971**0.522*0.4880.0460.679**0.4330.562*0.662**0.653**Alkali-N速效磷-0.025-0.761**0.994**10.964**0.580*0.538*0.1170.744**0.4690.613*0.721**0.696**Olsen-P速效钾-0.133-0.761**0.971**0.964**10.636*0.598*0.1740.669**0.587*0.690**0.749**0.756**Avail-K有机质-0.749**0.0090.522*0.580*0.636*10.971**0.854**0.849**0.944**0.982**0.960**0.973**Organic matter蔗糖酶-0.811**0.0470.4880.538*0.598*0.971**10.873**0.840**0.963**0.938**0.888**0.963**Invertase过氧化氢酶-0.924**0.4980.0460.1170.1740.854**0.873**10.656**0.852**0.802**0.717**0.751**Catalase酸性磷酸酶-0.490-0.1440.679**0.744**0.669**0.849**0.840**0.656**10.713**0.809**0.874**0.858**Acid phosphatase脲酶-0.822**0.0370.4330.4690.587*0.944**0.963**0.852**0.713**10.932**0.855**0.938**Urease细菌-0.717**-0.0700.562*0.613*0.690**0.982**0.938**0.802**0.809**0.932**10.969**0.965**Bacteria真菌-0.579*-0.1740.662**0.721**0.749**0.960**0.888**0.717**0.874**0.855**0.969**10.948**Fungus放线菌-0.684**-0.1600.653**0.696**0.756**0.973**0.963**0.751**0.858**0.938**0.965**0.948**1Actinomycetes
注：*、**分别表示在P<0.05、P<0.01水平上显著相关。
Note：*，**respectively in P < 0.05，P < 0.01 significant level.
2.4 土壤肥力综合评价
根据主成分分析原理，各主成分F1、F2得分等于因子得分乘以相应特征根的算术平均根，而综合评价得分以各主成分所占方差贡献率计算得到，即土壤综合肥力水平F分值=(69.355F1分值+25.690F2分值)/95.045。由表6可知，各处理综合肥力水平T4>T2>T3>T1>CK。
表5 供试土壤主成分特征值
Tab.5 Characteristic values of soil principal components
指标Item第一主成分First principal component载荷Loading capacity第二主成分Second principal component载荷Loading capacity土壤容重(X1)-0.222-0.6680.3680.673Soil bulk densitypH(X2)-0.060-0.179-0.526-0.962碱解氮(X3)0.2260.6800.3980.727Alkali-N速效磷(X4)0.2420.7270.3700.676Olsen-P速效钾(X5)0.2570.7730.3380.617Avail-K有机质(X6)0.3250.975-0.101-0.184Organic matter蔗糖酶(X7)0.3190.959-0.129-0.235Invertase过氧化氢酶(X8)0.2510.753-0.354-0.647Catalase酸性磷酸酶(X9)0.2970.8910.0380.069Acid phosphatase脲酶(X10)0.3080.925-0.142-0.260Urease细菌(X11)0.3240.972-0.063-0.116Bacteria真菌(X12)0.3220.9670.0140.026Fungus放线菌(X13)0.3300.991-0.014-0.025Actinomycetes特征值9.016-3.340-Characteristic value方差贡献率/%69.355-25.690-Variance contribution rate累积方差贡献率/%69.355-95.045-Cumulative variance contribution rate
表6 土壤综合肥力水平评价
Tab.6 Evaluation of soil comprehensive fertility level
处理TreatmentF1分值F1 scoreF1排名F1 rankingsF2分值F2 scoreF2排名F2 rankingsF分值F score综合排名Comprehensive rankingsCK-4.515-2.125-3.875T1-2.1242.731-0.814T21.4731.2121.392T31.642-0.4431.083T43.521-1.3742.201
3 讨论与结论
施肥是改善土壤肥力的重要措施之一，Masto等[30]、Blair等[31]等定位试验研究结果表明，长期施用厩肥可有效提高土壤有机碳与氮库，而无肥氮肥对土壤有机碳及氮库提升较小。林治安等[32]研究表明，化肥与有机肥均能提高土壤速效养分含量，二者差异在于化肥可以迅速提高速效养分含量并在这一水平上保持相对稳定，而有机肥则具有持续提高土壤速效养分含量的作用。本研究结果表明，施肥能有效改善土壤理化特性，且蚯蚓粪肥氮替代30%化肥氮处理(T2)较纯施化肥处理(T1)具有更显著的效果，而高比例的蚯蚓粪肥替代(替代50%及70%化肥氮)对土壤容重、pH及有机质具有较显著的效果，较T1处理对土壤速效养分影响相对较小。从肥料特性而言，化肥富含速效养分但容易淋溶，而蚯蚓粪疏松多孔具有一定的富集能力，虽富含有机养分但需经过一定时间的腐解才能充分释放[3，16-17]。适宜比例的有机肥替代化肥能综合二者的优点规避缺点，既能有效富集化肥中的速效养分减少淋溶，同时自身缓慢腐解释放养分，能有效保障烤烟生育前期对养分的需求，尽量减少后期腐解释放过量氮影响烤烟正常落黄成熟[32-34]。
王伟华等[35]在湖南省长期定位平台试验发现长期化肥配合秸秆还田或配施有机肥显著改善土壤养分含量和土壤微生物量、微生物群落结构和活性，对于培肥地力和优化土壤微生物群落极为重要。陶磊等[36]发现有机肥替代部分化肥土壤细菌、放线菌和假单胞杆菌数量均随有机肥用量的增加而升高，真菌数量则随有机肥施量升高而降低。本研究结果显示，较T1处理蚯蚓粪肥替代处理脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶分别增加16.45%～37.97%，22.99%～34.57%，18.40%～28.80%，10.19%～19.74%，而细菌数量增加43.22%～122.35%、真菌数量增加20.74%～55.87%、放线菌数量增加44.80%～76.64%。蚯蚓粪肥有自身携带大量有益微生物及有机质，能为微生物提供充足的养分来源，同时其疏松多孔的特性为微生物提供适宜的生存环境，促进微生物进一步扩增[16-17]。
土壤单一养分或肥力指标的变化能从一定角度反映土壤肥力的变化特征，但往往难以全面表征土壤的肥力[29，37]。简单相关性分析发现，土壤各肥力因子并不是相互独立的，相反，它们存在一定的相关关系，有的肥力因子间相关性达到显著甚至极显著水平，肥力指标间的这种相关性不仅反映了各肥力因子在土壤物质代谢与能量转化过程中密切相关，这也表明各数据反映的信息存在一定程度的重叠，若直接用这些数据评价土壤综合肥力，必然会影响评价结果的客观性。
为进一步确定各肥力指标的相关关系，综合评价土壤肥力，本研究采用主成分分析法，对13个复杂的土壤因子进行重提炼，通过分析提取出2个主成分，其中第一主成分累积方差贡献率最大达69.355%，对土壤肥力起主导作用，其中放线菌、有机质、细菌、真菌、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶具有较大的载荷，对第一主成分的影响较大，因此第一主成分反映了土壤有机质转化能力；而第二主成分累积方差贡献率为25.690%，其中pH、碱解氮、速效磷、土壤容重、过氧化氢酶、速效钾有较大的系数，这表明第二主成分代表土壤速效养分供应能力。综合模型表明，蚯蚓粪部分替换无机肥对土壤综合肥力影响差异主要体现在速效钾、速效磷、碱解氮、放线菌、真菌、酸性磷酸酶、细菌、有机质。第一主成分与第二主成分评分表明，不同施肥均能提高土壤肥力水平，高比例的蚯蚓粪增加了土壤有机质的转化能力这对持续提高土壤速效养分含量的作用具有重要作用，而高比例的化肥则增加了土壤速效养分供应能力[32]，土壤综合肥力评价显示T4与T2处理对土壤综合肥力改善较好。
一定比例的蚯蚓粪肥替代化肥能改善土壤肥力，增加土壤速效养分及有机质含量，提高土壤酶活性及微生物数量，并且蚯蚓粪肥替代化肥对土壤综合肥力影响主要因子为速效钾、速效磷、碱解氮、放线菌、真菌、酸性磷酸酶、细菌及有机质，综合肥力评价显示T4(蚯蚓粪肥氮替代70%化肥氮)效果最佳，T2(蚯蚓粪肥氮替代30%化肥氮)次之。
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