大蒜(Allium sativum L.)是百合科葱属(Allium)一、二年生草本植物，是一种重要的经济型作物。在生产上，主要以地下鳞茎作为繁殖材料，在中国栽培已有2 000多年的历史。由于大蒜含有大蒜素、糖类、蛋白质、抗坏血酸和多种还原性硫化物，因此，大蒜鳞茎具有非常高的烹饪、功能性和医学价值[1-2]。金乡蒜品质优良，辣味适中，营养丰富，是一种优质的大蒜品种[3]，年均产量100万t左右，大蒜出口合格率在90%以上，出口量占全国的70%以上。
在自然条件下，采后的大蒜具有休眠的现象，一般为2～3个月的生理休眠期，生理休眠期结束后常因高温而进入被迫休眠期，不同采收时间、不同品种的大蒜休眠期长短不同。未解除休眠前，即使给予其合适的生长条件，大蒜也不萌发生根，在农业生产上限制了大蒜的种植时间。并且大蒜在贮藏过程中鳞茎薄壁细胞衰退，其营养物质供给幼芽萌发生长，休眠结束后胚芽开始生长，代谢活动增强，表现为营养物质消耗增多，鳞片逐渐干枯腐烂[4]。大蒜鳞茎的呼吸随胚芽的生长而增强，鳞茎干物质含量的变化与呼吸速率变化相反，随胚芽生长而下降，蒜瓣中的可溶性糖含量下降，一部分作为呼吸基质被消耗，一部分转化为新芽中的蛋白质和VC[5]。其可溶性蛋白质及VC含量随新芽生长而增加。姜华武等[4]研究大蒜休眠解除后的生理生化变化结果表明，休眠后期呼吸强度、电导率、还原糖含量都不同程度地增加，多酚氧化酶、抗坏血酸酶与蔗糖酶均显著增加。这些休眠期的生理变化，会导致大蒜的品质下降，对后续大蒜的播种造成不利影响，对蒜农的经济利益造成一定的损失。研究一种快速打破金乡大蒜休眠的方法，对提前播种、及早上市、提高经济效益具有一定的现实意义。
樊治成等[6]研究证明低温(5 ℃)处理种蒜能够使鳞茎分化提早，但对植物后期生长有一定的不利影响，而较高温度(20，35或35 ℃)处理，促进了生长，却会使大蒜鳞芽分化较晚。探索低温处理的最适温度与处理时间可以有效解决鳞茎发芽晚的问题，同时对大蒜萌发后的生长无不利影响。
已有大量对激素影响休眠萌发的研究，解释说明了一些激素对于种子休眠与萌发的作用。在维持种子休眠而抑制种子萌发的过程中，脱落酸(ABA)发挥了极为关键的作用。赤霉素(GA3)可以解除种子休眠，促进种子萌发。乙烯对很多物种打破休眠起到重要的作用，能促进休眠种子萌发的有效浓度是0.1～200.0 μL/L[7]。
目前，对于大蒜打破休眠的方法，多集中在单一激素打破或单一温度处理，还未有人针对金乡大蒜的破眠方法进行针对性的研究。为此，本试验针对金乡蒜，利用GA3和ETH这2种对打破休眠有积极作用的激素和低温处理结合，筛选出最适于金乡蒜破眠的方式。
1 材料和方法
1.1 试验材料与设计
本试验选用品种为金乡蒜，休眠大蒜鳞茎取自常温下存储2周的鳞茎，萌发大蒜取自常温下存储16周的鳞茎。
1.1.1 最适激素浓度、温度筛选 将打破休眠和正处于休眠期的金乡大蒜的干燥鳞茎去皮分瓣，用网袋将不同处理分开，每种处理设置50粒大蒜。先分别用16种不同浓度的赤霉素(GA3)、乙烯利(ETH)混合液浸泡处理1 h(表1)，浸泡后取出，采用基质培养，10×10花盆播种，穴深8.5 cm，基质选用草炭、蛭石和珍珠岩以2∶1∶1混合，清水浇灌，分别放置在4，8，12，16 ℃的光照培养箱中培养，使其继续破土发芽。常温条件下培养的前一年的金乡蒜作为对照组。
表1 不同混合液中激素的浓度
Tab.1 Concentration of hormones in different mixtures
混合液Mixed homone赤霉素浓度/(mg/L)The concentrationof gibberellin乙烯利的含量/(μL/L)The concentrationof ethephonJ100J2050J30100J40150J5500J65050J750100J850150J91000J1010050J11100100J12100150J131500J1415050J15150100J16150150
1.1.2 最适低温处理时间的筛选 选用最佳激素配方处理大蒜1 h，取出放置在促进萌发最有效温度条件下处理4，8，12，16，20 d(表2)，对照处理为不做处理的前1年的金乡蒜。全部处理完成后，采用基质培养，10×10花盆播种，穴深8.5 cm，基质选用草炭、蛭石和珍珠岩以2∶1∶1混合，清水浇灌，放置在适合蒜苗生长的环境中，使其继续破土发芽。筛选出促进鳞茎萌发的最佳激素浓度和低温处理的最佳时长。
表2 不同低温处理时间
Tab.2 Different days of temperature treatment
处理Treatment激素Mixed hormone温度/℃Temperature低温处理天数/dDaysT1J8124T2J8128T3J81212T4J81216T5J81220
每天统计其发芽数，计算发芽率，成熟收获后测定其大蒜素、维生素C、可溶性糖含量，比较大蒜品质是否有差异。
1.2 相关指标
统计发芽数，计算发芽率，使用卷尺和数显游标卡尺分别测量大蒜萌发后第30天蒜苗的株高、假茎粗，计算其平均值，综合各项指标筛选出促进萌发并对大蒜后期生长无不良影响的最佳激素处理浓度、温度和低温处理时长。
大蒜成熟收获后测定其大蒜素、维生素C、可溶性糖含量。大蒜素含量的测定采用苯腙法[8]，维生素C含量的测定采用2，6-二氯靛酚比色法[9]，可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法[10]测定。
1.3 数据处理
数据采用IBM SPSS statistics 19和Excel进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同激素浓度处理、不同温度培养对大蒜萌发和生长的影响
根据图1可明显看出，对照组前1年的金乡蒜在常温条件下第30天已全部萌发，证明已经通过休眠期的大蒜不需特殊处理即可正常萌发。当年的金乡蒜，在相同激素处理中，4 ℃条件下生长的大蒜发芽率明显低于其他温度条件下的发芽率，12 ℃处理的大蒜发芽率明显高于其他温度的处理；而在相同温度处理中，J8激素混合液处理的大蒜在同一温度条件下的发芽率都要显著高于其他激素配方处理，证明J8混合液配方，即GA3 50 mg/L、ETH 150 μL/L处理最佳。根据图2-3萌发后第30天的假茎粗、株高可以看出，在相同激素处理、不同温度下生长的大蒜蒜苗假茎粗没有明显的差距，但株高差异较大，推测是由于低温有抑制大蒜生长的作用，因此，进一步筛选低温处理的最佳时间，以使大蒜在打破休眠、开始萌发后，能够在适宜的温度条件下快速生长。
图中不同小写字母表示差异显著性，P<0.05。图2-3同
Different lowercase letters in the figure indicate the level of significant difference，P<0.05.The same as Fig.2-3.
图1 不同混合液处理、不同温度培养第30天大蒜发芽率
Fig.1 The germination percent of garlic in 30th day after different hormone mix and temperature treatment
图2 萌发后第30天蒜苗假茎粗
Fig.2 The pseudostem diameter in 30th day after germination
图3 萌发后第30天蒜苗株高
Fig.3 The plant height in 30th day after germination
2.2 低温处理时间对大蒜品质和发芽率的影响
表3显示，在相同时间，用同一种激素J8混合液处理当年大蒜后，放置在低温12 ℃下的时间越长，大蒜的萌发越快，T5的大蒜萌发率最高，说明12 ℃处理20 d促进大蒜鳞茎打破休眠的效果最好。且表4表明，T5处理对收获的大蒜鳞茎的品质没有产生消极的影响，且大蒜素含量比对照显著提高了17.29%，其他品质性状与对照组相比无显著差异。而T1、T2处理与对照组相比，其大蒜素含量、可溶性糖含量和维生素C含量也有明显降低。
2组试验结果证明，激素和低温处理能够在不影响大蒜品质的前提下打破大蒜休眠，使其快速萌发。在此研究中，筛选得到能够促进大蒜打破休眠的最适处理方案，具体为赤霉素、乙烯利浓度分别为50 mg/L、150 μL/L的激素混合液处理1 h，配合低温12 ℃静置20 d时打破休眠、促进萌发效果最好，能够使金乡大蒜的休眠时间缩短40～60 d，对于大蒜成熟的品质也没有不利影响，其大蒜素含量与对照组相比有显著提高，其他品质指标和对照组差距不大。缺少了任何一个条件都达不到最佳的效果。
表3 不同低温处理时间对大蒜发芽率的影响
Tab.3 Effect of different time of low temperature treatment on germination of garlic %
处理Treatment发芽率Germination rate第10天10th第30天30th第35天35th第50天50thT10±0.33e0±0.33f18±0.33e25±0.33eT22±0.33e10±0.33e35±0.33d40±0.58dT315±0.33d40±0.33d48±0.58c55±0.33cT420±0.33c50±0.33c75±0.33b85±0.33bT530±0.58b80±0.33b96±0.33a100±0.33aCK84±0.33a100±0.33a100±0.33a100±0.33a
注：表中同列数据后的字母表示5%显著差异水平。表4同。
Note：Different letters in the column mean significant at the 5% level.The same as Tab.4.
表4 不同低温处理时间对大蒜品质的影响
Tab.4 Effect of different time of low temperature treatment on quality of garlic
处理Treatment大蒜素含量/(mg/g)Allicin contents可溶性糖含量/%Soluble sugar contents可溶性蛋白含量/(mg/g)Soluble protein contents维生素C含量/(mg/g)Vc contentT11.155±0.06c7.267±0.50cd7.373±0.035b1.969±0.004 6dT21.620±0.02b7.519±0.32c7.524±0.045ab2.118±0.006 8cT31.625±0.03b8.454±0.41ab7.695±0.024a2.246±0.020 7abT41.864±0.01a9.090±0.19a7.696±0.077a2.375±0.010 3aT51.906±0.03a8.458±0.25ab8.034±0.210a2.252±0.020 7ab对照CK1.625±0.01b8.454±0.31ab7.899±0.050a2.248±0.009 5ab
3 讨论
种子休眠是植物在长期进化过程中形成的一种适应环境变化的防御特性，此种特性能够保障植物在恶劣环境中存活，减少同一物种个体间的竞争，并且防止种子在不适宜的季节萌发[11]，有利于物种的延续。种子休眠的原因大致可分为2种，一种为生理性休眠，例如种胚形态发育尚未完成，生理上未成熟、缺少必需的激素或存在抑制萌发的物质[12]；另一种为物理因素的限制，如种壳的限制，机械阻碍等，或者环境条件的不适宜也会使种子进入被迫休眠。根据不同的分类标准，可以把休眠分为不同的类型，通常分为外源休眠、内源休眠和综合休眠[13]。大蒜的休眠期可分为3个阶段，第1阶段为休眠前期，为采收后的20～30 d，此时鳞茎和鳞芽外层的叶鞘将逐渐变薄，干缩成膜质鳞片。第2阶段是生理休眠期，也称作深休眠期，此时期为生理性休眠阶段，一般为30～60 d，此时的大蒜鳞茎即使在适宜生长的环境中也不会萌发生长。第3阶段为被迫休眠期，是由于环境条件不适宜，如高温，会使大蒜的萌发生长受到抑制，此为物理因素的限制所导致的休眠，所以大蒜仍处于休眠期[14]。种子休眠与萌发是一种非此即彼的现象，二者不可能同时出现。休眠期间，即使给予大蒜适宜的萌发环境，也不会顺利萌发。因此，可以在大蒜生理性休眠的阶段利用打破休眠必需的激素或诱导大蒜内部产生更多有利于萌发的激素的产生来促进大蒜萌发，能够使其避过后期高温环境导致的被迫休眠。
为了能够尽快打破休眠，在生产上进行种植或栽培，人们研究了打破各种植物种子休眠的方法和技术，以期能够按照自己的需求对种子进行破除休眠。打破休眠的方法可分为三类：物理方法、化学方法和生物方法[15]。物理方法主要是利用了温度和湿度对种子的影响[16]，例如有干燥使欧地笋(Lycopus europaeus)种子完成后熟[17]，小芸木(Micromelum integerrimum)种子在干燥处理后发芽率也得到了提高[18]；层积作用促进种子打破休眠，有低温层积和变温层积[19]，例如松柏等裸子植物在1～10 ℃冷湿处理后，其休眠逐渐消失；其他物理方法还有利用物理划痕使大豆尽快打破休眠[20]，用98%硫酸煮沸浸泡合欢树种能够提高其发芽率[21]等。化学方法包括激素处理，氧化剂、酸、碱和含氮化合物等化学物质处理。例如，用硫脲打破种薯的微休眠[22]，用大蒜提取物和GA3能够提早打破梨树的休眠[23]等。生物方法有利用生化物质，如细菌真菌等微生物来减轻或打破种子休眠。一种手段的处理能够对休眠的打破产生积极的影响，那么推断2种或3种手段的适当结合，应该能够对其产生更加积极的作用。
ABA作为种子休眠激素，主要是通过诱导并维持种子休眠来抑制种子萌发[24]。种子成熟后期，胚胎中ABA的积累达到最高水平[25]。ABA和GA3对种子萌发和休眠有相互拮抗的作用[26]。GAs可以解除种子休眠，促进种子萌发。GA3主要在种子萌发起始和胚根突出时发挥作用，而ABA几乎参与调控种子发育和萌发的全部过程[27-28]。经硝普钠(SNP)和ETH处理后，可显著提高独立种子内源乙烯的释放速度，通过促进内源乙烯的形成能够打破杜梨种子的休眠[29]。利用乙烯生物合成和代谢过程中的抑制剂和乙烯信号传导途径中基因的突变体研究表明，乙烯参与到种子的休眠和萌发过程，并通过调控ABA的代谢和信号传导途径对ABA产生拮抗作用[7]。并且乙烯可以与乙烯受体结合进而促进GA3的活性[30]。因此，ETH和GA3可以作为促进打破鳞茎休眠、促进萌发的重要激素。
而低温对种子萌发的促进作用，也有学者做出了研究，结果发现，黄檗种子经过低温层积处理后，发芽率明显高于未经低温处理的，而不论是应用植物生长调节剂还是渗透调节剂都需要结合低温处理才能获得较高的发芽率[31]。冷藏处理利于老鸦瓣鳞茎提前出苗，并显著缩短出苗时间且利于苗齐，但对出苗率影响不明显[32]。GA参与接触种子休眠的可能性依赖于种子的休眠状态，浅休眠的种子内存在GA3产生的条件，能够促进种子萌发，而深休眠的种子，外源GA3不能解除其休眠，而冷湿条件能够促使种子合成GA3[33]。低温通过诱导ABA分解代谢中的关键基因CYP707A2的表达，促使吸胀种子里的ABA含量逐渐降低进而促进种子萌发。GA和ABA协同调控种子萌发的机制可能是源于同一靶标基因-α-淀粉酶基因，它们均可调控α-淀粉酶基因的转录[34]。ABA/GA介导的低温对种子萌发调控模式[35]显示，DELLA为α-淀粉酶合成过程中的调控基因，GAs是通过DELLA依赖的一种方式调控Myb-like型转录因子结合到α-淀粉酶启动子的GA应答元件上，进而激活它们的表达。相反ABA下调α-淀粉酶的表达是通过诱导Ser/Thr激酶PKABA1、抑制GAMyb的转录来实现的。
因此，外源施加GA3和乙烯利，能够对ABA的调控作用产生阻遏，并且有利于增强GA3打破休眠的作用，并且针对刚收获的深休眠的大蒜，冷湿条件能够促进大蒜鳞茎合成GA3，进一步加快打破大蒜鳞茎的休眠。
前人对大蒜打破休眠的方法也进行了研究。肖杰等[36]研究指出，低温和赤霉素对解除玉林大蒜和成都大蒜蒜种休眠均有促进作用，因此，探索研究适宜浓度的赤霉素和乙烯利配方和低温结合处理，使金乡蒜快速打破休眠并萌发，同时又不影响大蒜的品质，对其种植具有重要的实践价值。
本试验基于前人对激素和低温对种子萌发促进的研究，结合物理和化学方法，从两方面入手，研究表明，利用GA3 50 mg/L、ETH 150 μL/L的激素混合液浸泡处理，后续使用低温处理，一方面外源赤霉素和乙烯利能够促进大蒜萌发，并抑制内源ABA的休眠作用，同时又可促进大蒜鳞茎内源GA3的生成，大大缩短了大蒜的休眠时间，能够帮助解决大蒜生产过程中的休眠时间过长的问题，减少大蒜休眠期营养品质的下降。
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