尖裸鲤5种组织乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的电泳分析

尖裸鲤(Oxygymnocypris stewartii)属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、尖裸鲤属(Oxygymnocypris)，别名斯氏裸鲤，俗称拉萨白鱼，为我国特有品种，主要分布于雅鲁藏布江中游3 000～4 500 m江段及各大干支流[1]。作为西藏地区市场价值相对较高的鱼类之一的尖裸鲤，由于人类活动加剧、鱼类栖息生境遭受影响等诸多因素，其鱼类资源量已大幅萎缩[2]，2006年以来各级政府已将尖裸鲤列为濒危水生野生动物并逐渐加大力度保护该物种[3]。目前关于尖裸鲤的文献主要集中在生物地理学[4]、细胞遗传特性[5]、发育生物学[6]和肌肉营养成分评价[3]，有关尖裸鲤各组织同工酶的报道较为少见，本研究借助聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对尖裸鲤5种组织进行了同工酶的电泳分析，目的在于从生化遗传学角度丰富尖裸鲤种质资源的相关研究内容。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究所用尖裸鲤样本来自西藏拉萨市曲水县，于2014年获得，共30尾，随机抽取其中4尾，体质量710～770 g。

1.2 试验方法

1.2.1 制备组织酶液和电泳组织酶液的制备和电泳参照张涛等[7]的方法。

1.2.2 染色及绘制模式图分别参照余来宁等[8]和张涛等[7]的方法进行乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的染色。待出现清晰条带后倒掉染液，并用去离子水漂洗凝胶板2～3次。将漂洗后的凝胶板轻轻平放在自制灯箱上，并用尼康数码相机拍照，结合相对迁移率根据电泳图谱绘制酶谱模式图。

1.2.3 酶的编号为了便于比较，同工酶的编号以迁移率最大的即向阳极方向泳动最快的编为1号，向阳极方向泳动次之为2号，其余依次为3号、4号、5号…

2 结果与分析

2.1 乳酸脱氢酶的表达

4尾样本鱼LDH的表达见图1，心脏中分别检测到12～16条LDH酶带，LDH2～LDH12为4尾样本鱼的共有酶带，1号鱼相对其余3尾样本鱼的酶带最少，仅12条，2号、3号和4号样本鱼酶带数相同，均为16条，LDH16活性最弱。除了心脏，LDH在4尾样本鱼的肾脏中酶带数也较多，分别检测到12～17条LDH酶带，1号鱼酶带仅12条，3号鱼共有17条LDH酶带。2号鱼和4号鱼酶谱相同。LDH1～LDH11以及LDH13为4尾样本鱼的共有酶带。3号鱼的LDH17、2号和4号鱼的LDH16活性都较弱。4尾样本鱼的肝脏中分别检测到6～10条LDH酶带，LDH3～LDH7以及LDH9为4尾样本鱼的共有酶带。4号鱼的酶带共有10条。1号鱼酶带仅6条。LDH1和LDH2仅在4号鱼中表达，而且活性都较弱。LDH在4尾样本鱼肌肉中表达偏弱，分别检测到6～13条LDH酶带，但共有酶带仅5条即LDH9～LDH13，1号鱼肌肉中LDH的酶带数最多，共有13条，与在心脏、肾脏和肝脏中的情况相反。4号鱼酶带数最少，仅6条。LDH在4尾样本鱼的眼睛晶状体中表达比较强，分别检测到17～18条酶带，LDH1～LDH17为共有酶带。1号鱼酶带数最多，共有18条，其余3尾酶带数相同。

2.2 苹果酸脱氢酶的表达

尖裸鲤的MDH分为上清液型(s-MDH)和线粒体型(m-MDH)，4尾样本鱼眼睛晶状体中MDH酶谱相同，共检测到4条酶带，其中m-MDH4活性最强，s-MDH1活性最弱。s-MDH和m-MDH均由2个基因座位编码。心脏中的表达程度比眼睛晶状体中略差，4尾样本鱼都检测到3条MDH酶带，s-MDH1和m-MDH2为共有酶带，s-MDH1表达活性最弱，m-MDH3只在4号鱼中有表达。肌肉中s-MDH表达活性比m-MDH强，4尾样本鱼分别检测到3～5条MDH酶带，其中s-MDH1活性最强，4号鱼酶带数仅3条。肾脏中MDH酶带条数较多，4尾样本鱼分别检测到4～7条MDH酶带，s-MDH1表达活性最弱，4尾样本鱼均能检测到s-MDH1、m-MDH5、m-MDH6和m-MDH7 4条酶带，4号鱼酶带数最多，共检测到7条MDH酶带。肝脏中分别检测到2条MDH酶带，s-MDH表达活性较弱，m-MDH2表达活性较强(图2)。

3 讨论

3.1 同工酶表达的组织特异性和个体差异性

从本试验的结果来看，尖裸鲤5种组织均能检测到乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶，说明这2种同工酶在尖裸鲤各组织中广泛存在，同时各组织中这2种同工酶的表达均具有组织特异性，具体表现在：同种同工酶在同一尾样本鱼不同组织中是否有表达、表达的酶带数多少以及表达活性不同。造成这种组织特异性表达的原因可能是由于组织或者器官中同工酶的表达受到遗传基因的调控，所以一些酶基因仅在专属的组织或器官中表达；另一方面也不排除是为便于不同组织行使不同的生理功能，从而使遗传因子表达后受到不同基因的调控，因而造成组织或器官间同类同工酶在含量和活性表达上的不同[9-11]。

另一方面，同一种同工酶在不同个体相同组织中的表达呈现出多态性，如本研究中LDH在1号鱼和2号鱼的肌肉中表达的酶带数不同，分析其原因可能是同工酶不同个体相同组织中的表达可能与不同个体、物种的发育阶段、是否患病、不同地理区域甚至不同环境条件都会有关联[12-13]。余敏等[14]报道了云南高背鲫鱼心脏EST-5在10尾样本鱼中仅部分表达，有几尾样本鱼心脏中并没有出现EST-5酶带。贺刚等[15]发现大口鲇(♀)×怀头鲇(♂)杂种F1心脏中POD酶带较为复杂，多态性高，而且活性较弱。

3.2 尖裸鲤乳酸脱氢酶在厌氧器官和非厌氧器官中的表达差异

LDH同工酶在糖代谢过程中起到重要作用，由LDH-A和LDH-B 2个基因编码，含5种同工酶：LDH1=B4、LDH2=AB3、LDH3=A2B2、LDH4=A3B和LDH5=A4，不同种同工酶代谢功能不同，乳酸被催化后转变成丙酮酸这一过程主要靠LDH1来完成，接着丙酮酸被有氧氧化为组织的生理活动提供能量；而在无氧酵解过程中LDH5扮演重要角色，它能使丙酮酸被催化成乳酸和NAD+，为组织行使生理功能提供能量[16-17]。本研究中除1号样本鱼外其余样本鱼肌肉中LDH酶带数在6～10条，总体少于心脏和肾脏的酶带数。LDH在尖裸鲤厌氧器官(骨骼肌和肝脏)中表达的含量总体少于非厌氧器官(心脏和肾脏)。LDH-B4在厌氧器官(骨骼肌和肝脏)中的迁移率也明显低于在非厌氧器官(心脏和肾脏)的迁移率。这一现象与杨太有等[18]研究黄河鲤乳酸脱氢酶的结果有相同的地方。尖裸鲤乳酸脱氢酶的特性与组织行使相应生理功能是密切相关的。

3.3 尖裸鲤乳酸脱氢酶与其他种鲤科鱼类乳酸脱氢酶的比较

目前，有部分关于裸鲤属生化遗传特性的报道，主要是关于青海湖裸鲤的研究，李太平等[19]比较了青海湖裸鲤与草鱼6种组织的乳酸脱氢酶，发现青海湖裸鲤乳酸脱氢酶酶带数比草鱼等鲤科鱼类多。祈得林等[20]对青海湖裸鲤血清过氧化物酶多态性进行了分析。孟鹏等[21]报道了青海湖裸鲤心脏等4种组织LDH等13种同工酶的差异表达，并对部分同工酶的基因位点和表达酶谱表型进行了分析。张才骏[22]、张武学[23]报道了青海湖裸鲤的心脏、眼睛晶状体、肌肉、肾脏和肝脏中LDH酶带数分别为12，12，13，12，8～14条，多于红鲤[23]红龙睛金鱼和鲫鱼[24]、朱蓝菲等[25]研究的20种鲤科鱼类。祁得林[26]比较了青海湖裸鲤和鲤鱼几种组织的LDH酶带数亦发现青海湖裸鲤的LDH酶带数要多，被检青海湖裸鲤的肝脏和肾脏LDH同工酶具有个体差异。魏乐[27]对青海湖裸鲤和鲤鱼血红蛋白进行了分析研究，并比较了两者种间差异和遗传特性。秦桂香等[28]比较了青海湖裸鲤和鲤鱼不同组织中过氧化氢酶的活性。Chen等[29]比较了藏北3种裸鲤LDH等3种同工酶的表达特性。本研究中尖裸鲤也有类似的现象，同组织LDH的酶带数尖裸鲤相对于红龙睛金鱼和鲫鱼[24]、红鲤[23]、朱蓝菲[25]研究的20种鲤科鱼类、草鱼[19]、鲤鱼[26]要多一些。青海湖裸鲤和尖裸鲤多数组织LDH酶带数都比一般鲤科鱼类要多，而且LDH同工酶具有个体差异。

造成上述现象的原因可能是：尖裸鲤所处的青藏高原具有气温偏低而且变化无常的气候、氧气相对含量也低以及水中饵料生物相对匮乏等特点，正是长期处于这种相对恶劣和太多相对不稳定的生态环境下，鱼类自身在漫长的进化过程中为适应复杂多变的环境也形成具有更大的变异性和丰富的遗传多样性。尖裸鲤相对多的LDH酶带数可能与其A亚基与B亚基发生变异有关[30]。关于这种变异的机制以及是否所有裸鲤属都有类似的特性尚待进一步研究。

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