近年来，全球土地盐渍化程度日益严重，已成为影响作物生产的重要因素。在高盐环境中，植物会通过多种策略维持细胞内的离子稳态，以减轻Na+引起的离子胁迫对植物造成的伤害[1-2]。高亲和性钾离子转运蛋白(High-affinity K+ transporters，HKT)参与控制K+的吸收和K+/Na+的选择性运输，提高植物抵抗逆境胁迫的能力[3-4]。HKT属于Trk/Ktr/HKT转运体家族，在离子运输过程中表现为双重性，即低Na+时充当Na+和K+协同转运体，高Na+时仅运输Na+，对调节细胞内Na+/K+动态平衡起着决定性作用[5-6]。植物HKT类蛋白由多个跨膜区和P-Loop组成，根据第一个P-Loop环关键部位氨基酸残基的种类，将该蛋白家族分为2个亚家族：P-Loop处含有丝氨酸的为Ⅰ型HKT类蛋白亚家族，是Na+特异性载体；P-Loop处含有甘氨酸的为Ⅱ型HKT类蛋白亚家族，是K+选择性载体[7-10]。最早从小麦中克隆得到HKT基因(TaHKT1)，其编码蛋白可介导高亲和的K+/Na+同向转运，而当Na+浓度升高时又可催化低亲和的Na+单向转运[11-12]。目前，已陆续在拟南芥、水稻、大麦、赤桉、杨树、芦苇、盐地碱蓬、盐角草等植物中鉴定出HKT家族的多个同源基因[13-16]。研究表明，不同植物的HKT基因及同种植物不同的HKT家族成员，在功能上往往存在差异[17]。拟南芥AtHKT1为HKT基因亚家族Ⅰ成员，主要介导Na+的吸收[18]。AtHKT1主要在维管系统中表达，通过移除木质部中的Na+提高植物的耐盐性[19]。AtHKT1还可将叶肉细胞中Na+转运到韧皮部筛管中，并运输到植物的根部，从而减少地上组织中的Na+积累[20]。在遭受盐胁迫时，AtHKT1过表达植株可以合成较多的海藻糖、龙胆二糖和棉子糖等渗透保护剂；AtHKT1缺失突变体对Na+的敏感程度明显增加，三羧酸(TCA)循环中间体的水平显著提高，显示糖类代谢的调节与植物盐胁迫的反应密切相关[1，18]。大豆中发现有4个HKT 家族成员(GmHKT1;1、GmHKT1;2、GmHKT1;3和 GmHKT1;4)，其中 GmHKT1;2 在大豆幼苗根中对低钾胁迫的响应明显高于其他3个基因，同时对低温、干旱、高盐和 ABA也有较强的响应[21]。水稻OsHKT1和OsHKT2主要在根中表达，参与调控根对Na+的吸收、转运来调节K+/Na+比[15]。小盐芥TsHKT1在高盐环境中通过选择性吸收K+，来维持K+/Na+平衡[22]。胡杨PeuHKT1基因能够在短时间内响应Na+而上调表达，吸收一定的Na+进入细胞内，以维持渗透压的平衡[13]。盐地碱蓬SsHKTl，转运K+而不转运Na+；SsHKT1表达受低K+和Na+处理诱导，而且在高盐条件下保持较高表达水平[23]。盐角草SeHKT1不仅能响应NaCl胁迫，还能在缺K+条件下提高表达，发挥高亲和K+载体功能[14]。
植物通过K+和Na+的转运响应盐胁迫是一个非常复杂的动态过程，受多种因素调控。HKT家族成员在其中发挥十分重要的作用。目前，有关HKT类蛋白K+和Na+转运方式的机制并不明确，本研究通过分析AtHKT1基因启动子在本生烟草中的表达水平，为进一步了解AtHKT1基因的作用机制提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 材料及试剂 本生烟草(Nicotiana benthamiana )种植和培养条件为：16 h光照、8 h黑暗，湿度保持在60%～70%，温度控制在22 ℃左右，光照强度为2 200 lux。限制性核酸内切酶、Primer STARTM HS DNA ploymerase、pMD18-T载体购自TaKaRa公司，Taq酶、T4 DNA连接酶、凝胶回收试剂盒购自Fermentas公司，引物合成和核酸测序由上海生工完成，大肠杆菌DH5α、土壤农杆菌GV3101和pCAMIA1300-gus载体由滨州学院生物与环境工程学院基因工程实验室保存。
1.1.2 培养基成分 基本培养基：MS；不定芽诱导培养基Y1：MS+1.5 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA；生根培养基Y2：1/2MS+0.1 mg/L IBA。
1.2 试验方法
1.2.1 AtHKT1基因启动子的克隆 根据GenBank数据库中拟南芥AtHKT1基因启动子(pHKT1)序列的相关信息，应用Primer Premier 5.0软件设计如下引物(下划线显示引入酶切位点的位置)，pHKT1 LP：5′-GCGAAGCTTGGTCATCTATATTTCTCAAATAG
TT-3′(HindⅢ)，pHKT1 RP：5′-ATAGGATCCG AGCTCTTTAGTTCTCGAGTCGGTTT-3′(BamHⅠ-SacⅠ)。以野生型拟南芥基因组DNA为模板，高保真PCR扩增pHKT1，连入pMD18-T载体。
1.2.2 重组质粒的构建 用Hind Ⅲ-BamH Ⅰ分别酶切pMD18-T-pHKT1和pCAMIA1300-gus，将回收的目的片段进行连接，从而构建pCAMIA1300-pHKT1载体。将含目的片段的表达载体转入农杆菌GV3101中。
1.2.3 本生烟草的遗传转化 将含pCAMBIA1300-pHKT1的农杆菌28 ℃振荡培养，当OD600为0.4～0.5时，离心后加入MS培养基重悬菌体。切取本生烟草叶片，置于菌液中侵染5 min，转入Y1培养基共培养2 d。用羧苄青霉素钠(Carbenicillin，Carb)除去农杆菌，用潮霉素(Hygromycin，Hyg)进行抗性植株的筛选。叶片在不定芽诱导培养基Y1+Hyg(25 mg/L)+Carb(500 mg/L)中进行分化培养。抗性芽在生根培养基Y2+Hyg(25 mg/L)+Carb(250 mg/L)中诱导生根。通过相应的分子生物学技术检测，最终获得外源基因高表达的转基因本生烟草。
1.2.4 GUS染色分析 将转基因本生烟草的幼苗、叶片、花、果实、种子等置于离心管中，加入适量的GUS染液(50 mmol/L pH值7.0磷酸钠缓冲液、10 mmol/L pH值8.0 Na2EDTA、0.5 mmol/L K3(Fe(CN)6)、0.5 mmol/L K4(Fe(CN)6)、0.1% TritonX-100和0.8 g/L X-Gluc)，在37 ℃条件下过夜染色。染色后的材料用70%乙醇进行脱色，获得待测组织，观察染色结果。
1.2.5 生物信息学分析 多序列比对及同源性分析采用ClustalW 和MEGA 软件；使用PlantCARE工具分析启动子序列；利用Arabidopsis eFP Browser对基因表达情况进行预测。
图1 基于不同植物HKT1蛋白氨基酸序列构建的系统进化树
Fig.1 The phylogenetic tree was built based on the different biological amino acid sequence of the HKT1 proteins
2 结果与分析
2.1 同源性分析
根据不同植物HKT1氨基酸序列信息，使用ClustalW软件进行序列比对，然后再利用MEGA软件进行系统进化分析。结果如图1所示，在所构建的系统进化树中，十字花科植物处于相同的进化分支，其中拟南芥和盐芥聚类在一起，表明它们之间有更近的亲缘关系和更相似的蛋白质序列特征；但拟南芥和水稻以及小麦等禾本科植物处于不同的进化分支，它们之间的亲缘关系相对较远，所以可以推测，AtHKT1的功能很可能与水稻以及小麦中的相应蛋白存在较大的差异。
2.2 AtHKT1组织表达水平预测
基因表达部位和表达量与基因功能之间具有密切的联系，根据基因的表达情况可以初步预测该基因的功能。为了了解AtHKT1基因在拟南芥不同器官和不同发育阶段的表达水平，利用在线工具Arabidopsis eFP Browser对AtHKT1基因的表达情况进行预测，结果显示(图2)，在拟南芥的不同组织和器官中，都可以检测到该基因的表达，尤其在花中表达十分强烈。此外，在叶片、根和果实中AtHKT1基因的表达量也较高。在拟南芥发育的不同阶段，AtHKT1的表达情况也不相同。在花发育的早期，AtHKT1表达水平相对较低，但在花发育的第15期，该基因的表达达到最高水平，尤其在花瓣、萼片和雄蕊中表达十分显著。
显著性测验，字母相同者差异不显著，字母不同者表示在0.05(小写字母)或0.01(大写字母)水平上差异显著。
The same letters represent insignificant difference; The different lower case letters represent significant differences at P<0.05 level;Capital letters represent extremely significant differences at P<0.01 level，by Duncan′s new multiple range test．
图2 AtHKT1基因在不同组织和器官表达水平预测
Fig.2 The expression level prediction of AtHKT1 gene in different tissues and organs
2.3 AtHKT1启动子顺式作用元件的分析
植物基因的启动子序列中包含许多重要的顺式作用元件，能够在转录水平上参与调控下游相应基因的表达，从而提高植物适应复杂多变环境的能力。利用PlantCARE工具对AtHKT1基因的启动子序列进行分析，结果表明(图3)，在AtHKT1的启动子内部存在多个重要的调控位点。这些顺式作用元件分别为：TATA-box(TATA/ccTATAAAaa)，它是启动子的核心元件，能与RNA聚合酶结合并调节转录的起始；CAAT-box(CCAAT)是启动子和增强子区域常见的作用元件，能
图3 AtHKT1启动子顺式作用元件
Fig.3 Cis-acting element of the AtHKT1 promoter
与转录因子相结合。G-box(CACGTG)是参与光应答的调节元件；GARE(CACGTG)是ABA响应元件；GARE-motif(AAACAGA)对GA诱导起响应的调控元件；TCA-element(CCATCTTTTT)是类似于烟草中参与水杨酸应答的调控元件；HSE(AAAAAATTTC)是响应热胁迫的调控元件；TC-rich repeats(GTTTTCTTAC)是参与防御和胁迫应答的调控元件。由此可以推测，AtHKT1基因表达很可能受到光照、激素和环境胁迫的调控。
2.4 转pCAMBIA1300-pHKT1本生烟草的获得
提取拟南芥的DNA，并通过PCR克隆启动子，将其插入pCAMBIA1300-gus质粒中，进而成功构建表达载体pCAMBIA1300-pHKT1，然后将其转入根癌农杆菌备用(图4-A)。通过农杆菌介导的叶盘法对本生烟草进行遗传转化。将农杆菌侵染后的叶片放入抗性芽筛选培养基中进行不定芽诱导，培养2周后，叶片上开始分化长出幼小的不定芽(图4-B)；进一步培养至第3周时，抗性芽已明显增大(图4-C)；随着培养时间的增长，抗性芽已产生2，3片叶片(图4-D)；当培养至第6周时，抗性芽的叶片已经长到4～5个，以备下一步的生根诱导(图4-E)；切取生长良好的抗性芽，将其转移至生根筛选培养基中进行生根诱导(图4-F)；培养8周后，不定芽的基部产生大量的不定根(图4-G)；将抗性苗从培养基中取出，洗净根部的培养基，种入营养土中，转入温室中进行培养(图4-H)。通过对筛选得到的本生烟草进行分子检测，最终获得转pCAMBIA1300-pHKT1本生烟草。
A.植物表达载体pCAMBIA1300-pHKT1；B.培养2周的叶片；C.培养3周的叶片；D.培养4周的叶片；E.分化诱导6周的不定芽；F.生根诱导；G.生根培养8周的试管苗；H.生长2个月的转基因植株。
A.The plant expression vector of pCAMBIA1300-pHKT1; B.Leaf blade cultured for 2 weeks; C.Leaf blade cultured for 3 weeks; D.Leaf blade cultured for 4 weeks; E.Adventitious buds induced by differentiation for 6 weeks; F. Root induction; G.Rooting induction for 8 weeks; H.Transgenic plants grown for 2 months.
图4 转pCAMBIA1300-pHKT1本生烟草的获得
Fig.4 The genetic transformation of Nicotiana benthamiana with pCAMBIA1300-pHKT1
2.5 AtHKT1基因组织表达水平分析
取转pCAMBIA1300-pHKT1本生烟草的幼苗、幼叶、成熟叶、花、花药、雌蕊、果实、种子、胚等进行GUS染色，分析AtHKT1在本生烟草中的组织表达水平，结果如图5所示。生长7 d的野生型烟草植株上未出现蓝色(图5-A)，转空载体幼苗几乎整株都为蓝色(图5-B)，转pHKT1-gus幼苗的叶片、维管系统及根部染色较深(图5-C、D)。成熟叶片AtHKT1基因表达水平明显降低，染色较深的部位主要是叶尖、叶柄、叶脉和叶毛(5-E、F)。本生烟草成熟时期花的GUS染色深浅不一，其中，萼片、花梗、花药、柱头、子房染色较深(图5-G-J)，表明这些部位AtHKT1基因表达量较高。即将发育成熟的种子一端染色较深，该部分为胚所处的位置(图5-K、L)。显示AtHKT1基因可能与胚的正常发育密切相关。
3 讨论
对作物而言，土壤盐渍化是最重要的非生物胁迫之一，NaCl的调节涉及非常复杂的代谢和运输现象[20]。植物具有多个Na+运输系统以规避Na+毒性，在拟南芥中发现存在多种Na+转运蛋白，包括SOS1、AtNHX和AtHKT1等[7]。其中HKT蛋白家族主要参与控制K+的吸收和K+/Na+的选择性运输，对提高植物抗胁迫能力具有重要的作用[3]。系统进化分析表明，拟南芥和禾本科植物小麦处于不同的进化分支，亲缘关系较远，提示AtHKT1的功能可能与小麦中相应蛋白存在一定的差异。与上述结果一致，拟南芥AtHKT1主要介导Na+的吸收；而小麦TaHKT1既可介导高亲和的K+/Na+同向转运，又可介导低亲和的Na+单向转运[12，18]。生物信息学分析显示，AtHKT1基因在拟南芥许多器官和组织中都有丰富的表达，进一步证实AtHKT1基因应该具有重要的生理功能。AtHKT1基因在叶和根中的表达量较高，这与AtHKT1介导叶中Na+外排，从根木质部细胞回收Na+的功能相一致[17]。此外，AtHKT1在花中表达十分强烈，表明该基因很可能与花的发育相关，体现出AtHKT1基因功能的复杂性。通过预测AtHKT1基因启动子顺式作用元件可以看出，除了核心元件外，还包括能够响应光、激素诱导，热、干旱和盐等环境胁迫的重要元件，这说明AtHKT1启动子可能是一个逆境响应启动子，AtHKT1基因表达很可能受到光、激素和环境胁迫的调控。近来的研究结果也初步证实了上述预测，细胞分裂素可以通过转录因子ARR1和ARR12控制AtHKT1在根中的表达，进而调节拟南芥芽中Na+的积累；ABI4(Abscisic acid insensitive，ABI)通过下调拟南芥根中AtHKT1的表达影响其耐盐性[24-25]。
A.野生型幼苗； B.转空载体幼苗；C.转pHKT1-gus幼苗；D.生长7 d的幼苗的叶；E.成熟叶；F.叶毛；G.完整的花；H.剥开的花；I.花药；J.雌蕊；K.种子；L.胚。其中图A-B bars=200 μm；图C-D、K-L bars=100 μm；图E bars=300 μm；图F和I bars=500 μm；图G bars=3 mm；图H bars=2 mm；图J bars=1 mm。
A.The wild-type seedlings; B.The seedlings with empty vector; C.The transgenic seedlings of pHKT1-gus; D.Leaves of seedlings growing for 7 days; E.The mature leaves; F.The leaf hairs; G.The intact flower;H.Peeled flower; I.Anther; J.Pistil; K.Seeds; L.Embryo.Scale bars=200 μm (A and B);100 μm (C， D， K and L);300 μm (E);500 μm (F and I); 3 mm (G);2 mm (H); and 1 mm (J).
图5 AtHKT1基因组织表达水平分析
Fig.5 Analysis of AtHKT1 gene tissue expression level
对转pHKT1-gus本生烟草幼苗进行GUS染色显示，叶片、维管系统及根部染色较深。该现象说明AtHKT1可能在这些区域表达量较高，有利于Na+的转运，进而调节植物耐盐性。植物的根及根毛具有吸收离子的功能，木质部和韧皮部是植物运输水分、营养物质和无机离子的主要通道，贯穿于植物的根茎叶。AtHKT1具有Na+的选择性运输功能，对拟南芥叶片中Na+外排、维持K+稳态和较高的K+/Na+比值具有重要作用。AtHKT1通过从根木质部细胞回收Na+和Na+从地上部分到根部的再循环，有利于减少地上部分Na+的积累[19，23]。本生烟草花的染色较深，尤其是萼片、花梗、花药、花柱、子房等部位，此外种子的胚染色也较深，表明这些部位AtHKT1表达较为强烈，这与Arabidopsis eFP Browser预测的结果相符合。上述结果提示，AtHKT1除了与Na+转运有关外，可能还有其他未知的功能，如：细胞分裂、花药和胚胎发育等。这进一步增加了AtHKT1功能的复杂性，因此，为了深入了解HKT类蛋白的作用机制，还需大量的工作要做。
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