表1 霍格兰溶液配方
Tab.1 Hoagland solution formulation
钾在植物中含量很高，是植物必需的大量元素之一，在植物的光合作用、气孔运动、蛋白合成和氧化代谢等生命活动中起重要作用[1-3]。缺钾时，会导致植物生长受限和代谢紊乱，严重缺钾时，植物甚至无法正常生长[4]。
研究表明，不同植物的钾含量不同。胡笃敬等[5]研究了30种植物的含钾量，包括水生植物、陆生野生植物、绿肥植物、早稻和晚稻等，结果发现，不同植物间的钾含量差别很大。此外，同一植物的不同品种钾含量也不同，如大豆[6]、燕麦[7]、小麦[8]、香蕉[9]、甘薯[10]、甘蔗[11]、玉米[12]、西瓜[13]、油菜[14]等。烟草品种间的烟叶含钾量，也存在明显差异[15-17]。杨欢等[18]研究了93份烟草种质资源材料的烟叶钾含量，并根据钾含量的高低，将这些种质材料分为高钾基因型、普通型与低钾型。
在分子层面，植物对外界钾的吸收，主要通过高亲和与低亲和2类吸收机制进行[3]。其中，低亲和机制主要是由位于细胞质膜上的钾离子通道承担，是植物吸收钾离子的重要途径之一[19-20]。例如，拟南芥钾离子通道的AKT1，是拟南芥根从外界获取K+的主要组分之一[21]。CIPK是一类植物特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[22]，CBL-CIPK信号系统广泛参与了植物钾吸收调节过程[23]。研究表明，在AtCBL1/9的介导下，AtCIPK23通过磷酸化AKT1，激活该离子通道，从而增强了拟南芥在低K+条件下对K+的吸收[24]。在水稻中，OsCBL1-OsCIPK23同样通过调控OsAKT1，参与了水稻的K+吸收[25]。在胡杨中，PeCBL1-PeCIPK23通过磷酸化钾离子通道PeKC1、PeKC2，从而实现其对低钾胁迫的响应[26]。还有研究表明，AtCIPK23在烟草中的过表达导致了转基因烟草低K+耐受性的增加[27]。此外，甘蔗CIPK23[28]、水稻CIPK10[22]、林烟草CIPK3[29]、普通烟草CIPK2等[30]均可能参与了植物对K+的吸收调节过程。
烟草是我国重要的经济作物，烟叶含钾量高低，是衡量烟叶品质的重要指标之一[31]。然而，目前对于烟草钾吸收的分子机制研究尚不够深入，尤其是NtCIPK基因参与钾吸收调控的研究还较少，其调控机制尚不清楚。因此，本研究对3个烤烟品种进行了不同K+浓度的处理，研究了其干质量、钾含量及NtCIPK家族11个基因的表达模式，并分析了这3个品种钾含量和其NtCIPK基因表达之间的关系，旨在为烟草钾吸收调控的分子机制研究提供一定的参考。
参试烤烟品种为K326、贵烟5号、云87。
试验所需的TRIzol试剂、cDNA合成试剂盒、SYBR Green Master mix等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2.1 不同钾浓度培养溶液的配制 不同钾浓度的培养液，在霍格兰溶液配方基础上进行适当调整配制而成(表1)。用氯化钾调整培养溶液的钾浓度分别为6.0，1.0，0.2 mmol/L，其他不变。
表1 霍格兰溶液配方
Tab.1 Hoagland solution formulation
1.2.2 烟草幼苗的培养与处理 挑选大小一致且饱满的烟草种子，表面消毒后，分别播种在白色泡沫漂浮育苗盘(长65.5 cm、宽33.5 cm、高4.5 cm、162穴)中，然后，将育苗盘放置在育苗池中进行育苗。育苗池中加注K+浓度为6 mmol/L的霍格兰溶液。60 d后，每品种挑选长势一致的幼苗各90株，分为3组，分别放入K+浓度为6.0，1.0，0.2 mmol/L的霍格兰溶液中，进行处理。每个处理包括30株烟苗，10株烟苗为一个重复，共重复3次。
处理48 h后，对每个浓度每个品种的烟苗进行随机取样。取样时，取每个重复烟苗叶片混合样，在液氮中速冻后，置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA的提取。
处理28 d后，将参试的全部烟株取出，并将根部冲洗干净，用吸水纸吸干水分后，在烘箱中105 ℃杀青30 min，80 ℃下烘干至恒质量待用。
1.2.3 烟株干质量及钾含量的测定 用电子天平称取烟株的干质量。植株钾含量的测定采用火焰光度计法[32]进行。
1.2.4 NtCIPK基因的表达模式分析 RNA的提取：采用TRIzol法进行，cDNA的合成参照试剂盒说明，具体参照卓维等[30]的方法进行。
表2 引物序列
Tab.2 Primer sequences
引物设计：根据四川农业大学农学院的分子生物技术验室前期所克隆到的11个NtCIPK基因的cDNA序列，采用Primer Premier 5.0设计qPCR引物(表2)。
qPCR扩增：以反转录后的cDNA为模板，以烟草18S rRNA为内参进行qPCR扩增。qRT-PCR扩增体系为：2×Prime STAR Max 5.0 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。qRT-PCR扩增程序为：50 ℃反应2 min，95 ℃预变性3 min；然后，95 ℃变性10 s，65 ℃延伸45 s，进行39个循环。基因相对表达水平用2-ΔΔCt方法进行计算。
在不同K+浓度处理下，各品种生物量的测定结果如图1所示。随着培养液K+浓度的降低，各品种的植株干质量均呈下降趋势。在1.0，0.2 mmol/L K+浓度处理下，云87与贵烟5号的干质量差异不显著，但在0.2 mmol/L K+浓度处理下云87与贵烟5号的干质量均显著高于K326；在6.0 mmol/L K+浓度处理下，贵烟5号的植株干质量显著低于K326和云87，后二者之间的差异则不显著。烟草植株生物量的测定结果表明，外界供K+量的高低，显著影响到烟草植株的生长与干物质的积累。
图中每个浓度不同品种的不同小写
字母表示在P<0.05水平上差异显著。图2-3同。
Different lowercase letters in each concentration of the figure
indicate significant difference atP<0.05.The same as Fig.2-3.
图1 各品种烤烟不同K+浓度处理的干质量
Fig.1 Dry weight of different varieties of flue-cured tobacco treated with different K+ concentrations
图2为不同K+浓度处理下，各处理烟草植株钾积累量(株/g)测定结果。随培养液中K+浓度的降低，各参试材料植株的钾积累量都呈下降趋势。在6.0，1.0 mmol/L K+浓度处理下，云87的钾积累量显著高于K326及贵烟5号；而在0.2 mmol/L K+浓度处理下，云87与贵烟5号和K326的钾积累量差异显著。钾积累量的测定结果表明，不同烟草品种在不同的外界K+浓度环境中，其植株的K+积累特性明显不同。
图2 各品种烤烟不同K+浓度处理的K+积累量
Fig.2 K+ accumulation of different K+ concentrations of flue-cured tobacco of different varieties
对在不同K+浓度处理下，11个NtCIPK基因在各烟草品种中的表达进行了测定，结果如图3所示。
从图3可以看出，NtCIPK基因的表达均随着外界钾浓度的变化而改变。在低钾条件下(0.2 mmol/L)，其表达量基本是上调的，其中,云87的11个NtCIPK基因表达量均高于对照K326，且存在显著性差异，显示这些基因的表达受低钾胁迫的诱导。但NtCIPK9和NtCIPK24分别在K326及贵烟5号中的表达，随着外界钾浓度的降低,却呈下调趋势，即随着K+浓度的降低而下调，都分别显著低于云87的表达量。在所检测的11个NtCIPK基因中，NtCIPK2、NtCIPK5、NtCIPK6、NtCIPK9、NtCIPK12、NtCIPK14、NtCIPK23和NtCIPK24随着K+浓度的降低，表达量变化较大。可以推测，这8个NtCIPK基因可能以某种直接或间接的方式参与了烟草钾吸收的调控。
图3 不同烤烟品种在不同K+浓度处理后的NtCIPK基因的相对表达量
Fig.3 Relative expression of NtCIPK gene after treatment with different K+ concentrations in different flue-cured tobacco varieties
2.4.1 逐步回归分析 将各处理烟草植株的K+积累量(Y)与11个NtCIPK基因的表达量进行逐步回归分析，得出了3个烟草品种在3个钾浓度处理下的逐步回归方程(表3)。
对K326来说，NtCIPK12(X7)、NtCIPK18(X9)和NtCIPK3(X2)的表达，分别在6.0，1.0，0.2 mmol/L条件下，对其K+积累量影响显著。贵烟5号的情况有所不同，其K+积累量在6.0，1.0 mmol/L条件下与NtCIPK5(X3)的表达密切相关；而在0.2 mmol/L条件下，则受NtCIPK3(X2)表达的显著影响。NtCIPK23(X10)的表达，在外界高K+浓度(6.0 mmol/L)下，与云87植株的K+积累量相关性显著；而在中(1.0 mmol/L)、低钾浓度(0.2 mmol/L)下，云87植株的K+积累量则与NtCIPK9(X5)的表达相关性显著。
2.4.2 通径分析 在回归分析的基础上，对NtCIPK3(X2)、NtCIPK5(X3)、NtCIPK9(X5)、NtCIPK12(X7)、NtCIPK18(X9)及NtCIPK23(X10)做了进一步的通径分析(表4)。
从逐步回归方程和通径分析结果来看，在外界0.2 mmol/L K+浓度下，NtCIPK3(X2)的表达与K326和贵烟5号的植株钾积累量分别呈显著正相关和显著负相关。同时，NtCIPK5(X3)在6.0 mmol/L浓度下的表达，与贵烟5号的植株钾积累量呈显著正相关。此外，在6.0 mmol/L K+浓度处理下，云87的植株钾积累量与NtCIPK23(X10)的表达显著负相关。
表3 各烤烟品种的K+含量和NtCIPK基因表达模式的逐步回归方程
Tab.3 Stepwise regression equations of K+ content and NtCIPK gene expression pattern of various flue-cured tobacco varieties
品种Variety处理/(mmol/L)Treatment逐步回归方程Stepwise regression equationK3266.0 Y=0.089 5-0.009 7X71.0Y=0.042 9-0.019 2X90.2Y=-0.039 2+0.107 9X2贵烟5号6.0 Y=-0.001 8+0.013 6X3Guiyan 51.0 Y=0.017 2+0.000 9X30.2Y=0.072 4-0.064 2X2云876.0 Y=0.119 4-0.011 3X10Yun 871.0 Y=0.139 7-0.012 8X50.2Y=0.066 8-0.005 9X5
注： Y.对应各浓度烤烟品种的K+含量；X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11分别代表NtCIPK2、NtCIPK3、NtCIPK5、NtCIPK6、NtCIPK9、NtCIPK11、NtCIPK12、NtCIPK14、NtCIPK18、NtCIPK23、NtCIPK24基因的相对表达量。表4同。
Note: Y. The K+ content of the corresponding flue-cured tobacco varieties；X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, and X11 represent relative expression levels ofNtCIPK2,NtCIPK3,NtCIPK5,NtCIPK6,NtCIPK9,NtCIPK11,NtCIPK12,NtCIPK14,NtCIPK18,NtCIPK23, andNtCIPK24 genes, respectively. The same as Tab.4.
表4 各烤烟品种的K+含量和NtCIPK基因表达模式的通径分析
Tab.4 Path analysis of K+ content and NtCIPK gene expression patterns of flue-cured tobacco varieties
品种Variety处理/(mmol/L)Treatment因变量Dependent variable自变量Independent variable相关系数Correlation coefficient通径系数Path coefficientt检验值t test value显著性检验值SigK3266.0YX7-0.009 7-0.879 8-1.851 30.315 31.0YX9-0.019 2-0.972 8-4.202 50.148 70.2YX20.107 90.999 845.929 40.013 9贵烟5号6.0YX30.013 60.998 820.217 70.031 5Guiyan 51.0YX30.000 90.996 311.546 30.055 00.2YX2-0.064 2-0.999 9-67.456 70.009 4云876.0YX10-0.011 3-0.998 7-19.767 40.032 2Yun 871.0YX5-0.012 8-0.971 7-4.116 30.151 70.2YX5-0.005 9-0.994 7-9.709 90.065 3
本研究通过对3个烟草品种进行不同K+浓度处理，测定了其干质量、钾积累量，并分析了11个NtCIPK基因在各个处理下的表达量，结果表明，NtCIPK基因的表达量与烟草的钾积累量密切相关。
前人研究结果表明，植物的CIPK基因在植物对K+的吸收调控过程中起着重要的作用[23-26]。在本研究中，烟草11个NtCIPK基因在不同品种中的表达量并不相同，并且均能够响应外界钾浓度的变化，这与前人的研究结果相一致[25,28-30]。此结果暗示，烟草的NtCIPK基因广泛参与了烟草对钾的吸收调控过程。
植物的CIPK基因参与钾吸收调控的机制较为复杂。一般情况下，其过表达能够增强植物对钾的吸收[24-27,33 ]。然而，拟南芥AtCIPK9[34]的过表达则导致对低K+敏感；玉米ZmCIPK9[33]的过量表达却提高了钾的吸收能力。由此说明，不同的NtCIPK基因在植物钾吸收过程中的调控机制不尽相同。本研究也发现，从NtCIPK基因的表达模式来看，随着外界钾浓度的降低，其表达可以分为上调及下调2种情况。有9个NtCIPK基因是上调表达，只有K326的NtCIPK9与贵烟5号的NtCIPK24的表达为下调。其中，上调表达的基因，就包括了与前人的研究结果相一致[29-30, 35]的CIPK2、CIPK3、CIPK23基因。烟草NtCIPK基因的这种不同表达模式，在一定程度上说明了其参与烟草钾吸收调控时，存在正调控、负调控或者其他的复杂方式。
逐步回归和通径分析的结果同样说明，在11个NtCIPK基因中，其表达量与烟草钾积累量的相关性存在显著与不显著之别；即使对同一个基因来说，其在不同品种中的作用也不尽相同。例如，同样在0.2 mmol/L K+浓度处理下，NtCIPK3(X2)与K326的K+含量呈显著正相关；然而，与贵烟5号的K+含量则呈显著负相关。该结果同样说明了烟草NtCIPK基因行使钾吸收调控功能的复杂性。
虽然烟草NtCIPK基因广泛参与了烟草对钾的吸收与调控，然而，其参与的方式、调控的模式与功能行使的途径却十分复杂。而每一个NtCIPK基因在其中发挥作用的详细机制，则需更进一步地深入研究。
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