淀粉(Amylum)作为植物中重要的贮藏多糖，是植物种子的主要成分。淀粉可以为食物提供80%的能量，是食物的重要组成部分[1]。玉米是三大粮食作物之一，随着时代的进步和科技的发展，淀粉已经成为一种重要的商业产品，在能源、医药、化工等领域的应用，已进入稳步健康发展阶段[2]。在玉米籽粒中，淀粉的比例达到70%左右，因此，淀粉的质量对玉米的质量有直接的影响[3]。植物体内淀粉的合成是一个复杂的生理过程，它是由几种酶共同催化下，以蔗糖为起始原料，进行一系列生理生化反应合成的[4]。而其中ADPG焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成代谢途径中起始关键限速酶[5]。因此，深入研究AGPase，对淀粉的合成起到重要作用，有利于研究淀粉生物合成的分子机制及其调控。
有研究表明，AGPase的活性影响淀粉的合成。在植物的叶和块茎中，通过效应子3-磷酸甘油酸的激活作用和无机磷酸的抑制作用，AGPase的活力与光合作用活性相协调[6-7]。Stark等[8]在马铃薯中转入AGPase，结果发现，增加了35%的淀粉产量。同样， Wang等[9]研究中，构建AGPase与胚乳组织特异启动子的重组载体，并将其转入到玉米中表达，结果发现，种子质量增加了22%～25%。另外，发现了一种大肠杆菌突变体，将其转进水稻进行表达，水稻的产量提高了11%[10]。因此，深入研究AGPase，提高其活性，有利于淀粉产量的增加，对作物的育种研究有重要的意义。
高等植物的AGPase是由2个大亚基(LSU)和2个稍小的小亚基(SSU)组成的一个异源四聚体酶(α2β2)。一般大亚基对AGPase具有调控的功能，而小亚基则具有催化功能[11]。AGPase有多种类型的同工酶，并且有多个基因编码。其中，玉米AGPL2是AGPase同工酶的一种大亚基，主要存在于胚乳中，编码518个氨基酸。它可以与AGPase其他亚基组成一种或几种形式的AGPase。水稻胚乳AGPase是由2个小亚基(AGPS2b)和2个大亚基(AGPL2)组成的异源四聚体，在其催化作用下在细胞质中合成ADP-葡萄糖[12]。而且在水稻胚乳中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPL2和AGPS2b)的表达水平在空间上与淀粉颗粒的差异性分布是相关的，并且编码ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的AGPL2和AGPS2b的转录水平似乎调节颖果发育时期淀粉颗粒的异步发育[13]。有研究表明，改变AGPase 7种亚基的组合方式和结构，能够增强土豆(Solanum tuberosum)块茎[7，14]、玉米(Zea mays)[15]、小麦(Triticum aestivum)[16]和水稻(Oryza sativa)种子[17]中AGPase的活性和淀粉的积累。因此，设计玉米AGPL2特异性引物，构建原核表达载体，使其在E.coli能够高效表达，纯化目的蛋白并制备AGPL2多克隆抗体，为研究玉米AGPL2蛋白的表达分析、AGPase的活性乃至淀粉的合成奠定基础。
以四川农业大学玉米研究所选育的中国西南地区优良玉米骨干系08-641(R08)为材料，该材料特点为淀粉含量较高。
本研究所用的主要试剂：反转录试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ以及DNA连接酶和蛋白酶抑制剂等(TaKaRa)；蛋白质亲和纯化介质GSH-coupled Agarose Affinity Matris(Genstar)、NC膜(Hybond C Extra)；弗氏完全佐剂和不完全佐剂(Sigma)、HRP标记的羊抗兔抗体(Abbkine)；Quick StartTMBradford 1x dye reagen(Bio-Rad)、HRP-DAB显色试剂盒(Thermo)、蛋白分子量预染蛋白Marker(Solarbio)、WB-MASTER Protein Standard(GenScript)。其他试剂均为国产分析纯试剂。雌性新西兰大白兔，质量为1.5～2.0 kg，由达硕实验动物中心提供。
1.2.1 PGEX-6T-1-AGPL2原核表达载体的构建 玉米授粉后20 d，分离胚乳，提取总RNA，并反转录成cDNA后置于-20 ℃冰箱保存备用。Primer 5.0软件设计AGPL2带有EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的上下游引物。通过PCR从玉米胚乳cDNA中扩增目的片段，连接至pMD-19-simple-T载体扩增后，用EcoRⅠ和Sal Ⅰ双酶切回收AGPL2基因片段，与同样双酶切后的表达质粒PGEX-6T-1定向连接，用CaCl2化学法通过热击转化E.coli DH5α菌株，涂板后倒平板培养过夜，挑取单菌落于1 mL Luria-Bertani(LB)液体培基(含100 μg/mL氨苄青霉素)中，37 ℃振荡培养4～6 h，进行菌液PCR检测，选取能够检测到目的条带的菌液扩大培养并用碱裂解法提取质粒，进行EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切验证，然后将重组质粒送到测序公司进行最后确认。
1.2.2 GST-AGPL2融合蛋白的诱导表达 将经过确认的重组质粒转入E.coli 表达感受态细胞BL21，涂板并倒平板过夜培养，挑取单克隆于1 mL LB(含100 μg/mL氨苄青霉素)中，37 ℃培养4～6 h，然后进行菌液PCR检测。将检测正确的菌液接种于LB(含100 μg/mL氨苄青霉素)中，37 ℃振荡培养，使菌液OD600在0.4～0.8，加入0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于28 ℃诱导表达6 h。分别在诱导0，3，6 h时取1 mL菌液，收集菌体，用100 μL超纯水重悬菌体，加入蛋白上样缓冲(20 mmol/L Tris-HCl，0.4% SDS，5%甘油，1% β-巯基乙醇，0.02%溴酚蓝，pH值6.8)，煮沸裂解5～10 min，离心(12 000 r/min，2～5 min)，吸取上清进行10% SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测重组蛋白的表达。
1.2.3 GST-AGPL2融合蛋白的纯化 将融合蛋白表达成功的菌液离心(4 ℃，4 000 r/min，5～10 min)，去上清收集菌体，重悬于PBS缓冲液，离心去上清，重复2～3次。然后用PBS重悬菌体并加入蛋白酶抑制剂，置于冰上，超声破碎使细胞裂解，离心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)收集上清。将上清加入预先平衡的含Glutathione beads的纯化柱中，在4 ℃摇床过夜结合。去除上清，用5～10倍柱体积的PBS缓冲液洗涤beads。再用洗脱液洗脱，收集组分，重复5次。最后将收集的蛋白各取出10 μL进行10% SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测。
1.2.4 多克隆抗体的制备 购买2 kg新西兰大白兔，适应环境3～4 d。取兔耳静脉血约500 μL，分离血清作为阴性对照。血液于37 ℃放置2 h，然后4 ℃放置过夜；离心(4 ℃，4 000 r/min，10 min)，收集上清，重复2～3次；血清中加入15%的甘油和0.2‰的叠氮化钠，混匀后置于-80 ℃保存。第一次免疫新西兰大白兔时，将纯化的蛋白和不完全佐剂按1∶1混合，直至1 000 r/min离心不分层，然后多点注射兔子皮下。再次注射时，纯化的蛋白和完全佐剂按1∶1混合。每隔14 d免疫一次，连续免疫4次。最后一次注射7 d后，在兔子的颈动脉处取所有血液，分离血清并Western Blot检测评价抗血清。
1.2.5 GST-AGPL2蛋白rTEV Protease酶切反应 取7.5 μg纯化的GST-AGPL2融合蛋白，总体系为150 μL，pH值7.0，加入rTEV Protease(3 μL 25 U)30 ℃孵育，在0，1.5，3.5，6.5 h分别取出30 μL反应液，然后各取出10 μL约 500 ng蛋白进行Western Blot检测。
1.2.6 玉米不同组织蛋白的提取及蛋白定量 将样品在液氮中研磨至粉末，称质量，以1 g样品加入2 mL蛋白提取液(100 mmol/L Tris-HCl，pH值7.0，40 mmol/L β-巯基乙醇，10 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，15%甘油)的比例加入适当的提取液，并加入蛋白酶抑制剂，混匀，放置冰上30 min；离心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，收集上清，重复2次；在1 mL快速测定蛋白浓度反应液中加入2 μL的上清，测OD595以确定其蛋白浓度。
1.2.7 Western Blot试验 Western Blot采用湿转法，在SDS-PAGE结束后，电压90 V，转膜2 h；用丽春红染液染色5 min，观察实际的转膜效果，TBST(150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0，0.05% Tween 20)洗膜3次，每次5 min；加入封闭液(含有5%脱脂奶粉的TBST)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1 h；将AGPL2多克隆兔抗体按照适当比例用TBST稀释，4 ℃缓慢摇动孵育过夜，回收一抗，TBST洗膜4次，每次10 min；将HRP标记的羊抗兔IgG按照1∶10 000稀释，室温孵育1 h，回收二抗，再用TBST缓冲液清洗膜4次，每次10 min；加入1∶1混合均匀的显影液和定影液，进行化学发光显影。
为了构建原核表达载体PGEX-6T-1-AGPL2，选取PGEX-6T-1作为目标载体，该载体含有一个GST标签，GST与目的基因间还有一个TEV Protease酶切位点，可以在试验需要时去除GST标签(图1-A)。以玉米胚乳cDNA为模板，PCR扩增得到AGPL2基因片段，其大小为1 500 bp左右，与理论分子量相符(图1-B)。经酶切、连接反应成功构建PGEX-6T-1-AGPL2载体。将重组质粒PGEX-6T-1-AGPL2进行EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切验证，获得条带大小约为1 500 bp的片段，与预期结果一致(图1-C)。进一步测序验证，表明PGEX-6T-1-AGPL2表达载体构建成功。
A. 载体构建；B.AGPL2 PCR扩增；C. 重组质粒的酶切鉴定。
A.Vector construction； B. PCR amplification ofAGPL2；
C.Identification of recombinant plasmids by restriction enzyme digestion.
图1 PGEX-6T-1-AGPL2的PCR扩增和酶切验证
Fig.1 Identification of plasmid by PGEX-6T-1-AGPL2 PCR and enzyme digestion
由上步获得的PGEX-6T-1-AGPL2质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组工程菌株。在0.5 mmol/L IPTG诱导下，GST-AGPL2融合蛋白的表达量增加，蛋白分子量约83 ku，与理论分子量相符(图2-A)。并且在28 ℃条件下，用0.5 mmol/L IPTG诱导6 h，目的蛋白表达量随诱导时间的增加而增加，说明目的蛋白在此条件下能够得到高水平表达。为获得足够量的AGPL2蛋白，先后纯化得到6管浓度不一的蛋白，其条带比较单一，蛋白质量较高(图2-B)。用已知的不同浓度BSA作对照，6管蛋白浓度介于10～200 ng/μL；其中第6管蛋白浓度最高，介于50～200 ng/μL。这些结果表明，GST-AGPL2重组蛋白成功被纯化，可用作抗原制备抗体。
A. GST-AGPL2融合蛋白诱导表达的考马斯亮蓝染色；B. GST-AGPL2融合蛋白纯化的考马斯亮蓝检测；
1-6.纯化的GST-AGPL2融合蛋白。
A. The expression of GST-AGPL2 fusion protein was detected by Coomassie brilliant blue staining；
B. The purification of GST-AGPL2 fusion protein was detected by Coomassie brilliant blue staining；1-6.Purified GST-AGPL2 fusion protein.
图2 GST-AGPL2融合蛋白的诱导表达与纯化
Fig.2 Induced expression and purification of GST-AGPL2 fusion protein
将上步获得的高质量纯化蛋白，免疫新西兰大白兔，分离血清，获得兔多克隆抗体。为了验证AGPL2抗体的特异性，将上步纯化得到的GST-AGPL2融合蛋白用rTEV Protease去除GST标签，进行Western Blot检测(图3)。结果表明，rTEV Protease酶切前抗体能够特异地检测到GST-AGPL2蛋白条带，酶切后抗体检测到GST-AGPL2、AGPL2和GST这3条带，且随着酶切时间的增加AGPL2条带的信号逐渐增强，说明AGPL2抗体能够特异地检测纳克级抗原，具有很好的特异性和灵敏性。
抗体稀释比例为1∶5 000。
Antibody dilution ratio is 1∶5 000.
图3 GST-AGPL2重组蛋白的rTEV Protease酶切
Fig.3 Digestion of GST-AGPL2 recombinantprotein by rTEV Protease
在体外，AGPL2抗体能识别其抗原，但是否能识别玉米体内的蛋白还不清楚。因此，为了研究玉米内源AGPL2蛋白是否能被制备的抗体识别及AGPL2表达模式与分布情况，提取玉米08641不同组织及其授粉后不同时期的胚乳蛋白，进行Western Blot检测，结果表明，玉米不同组织中检测到的信号强弱不一，说明AGPL2蛋白在不同组织中的表达具有组织特异性(图4-A)。胚乳中AGPL2蛋白的表达量最高，其次是胚，而在根、茎和叶中表达量很少甚至检测不到，说明AGPL2蛋白功能主要在胚和胚乳中。淀粉主要在胚乳中积累，为了进一步研究在淀粉积累中胚乳AGPL2的表达模式，分离授粉后不同阶段的胚乳，提取总蛋白并进行Western Blot检测，结果表明，在授粉10 d内AGPL2蛋白含量很少，10～15 d AGPL2蛋白的表达量剧增，在15，20 d的信号最强，随后逐渐减弱(图4-B)。这一结果与淀粉的积累模式相符，说明AGPL2在淀粉的积累过程中可能参与了淀粉的合成。也表明AGPL2抗体能够很好地识别玉米胚乳内的抗原。以上结果说明，AGPL2多克隆抗体能特异地识别玉米体内的蛋白。在玉米中，AGPL2的表达主要在胚乳中，尤其在授粉后15，20 d表达水平较高。
A.玉米AGPL2蛋白在不同组织的分布检测，抗体稀释比为1∶2 000；
B.玉米胚乳中的AGPL2蛋白在授粉后不同时期的表达检测，抗体稀释比为1∶5 000。
A.Distribution of maize AGPL2 protein in different tissues，antibody dilution ratio is 1∶2 000；
B. Expression of AGPL2 protein in maize endosperm at different stages after pollination；antibody dilution ratio is 1∶5 000.
图4 玉米AGPL2蛋白的表达及分布
Fig.4 Expression and distribution of AGPL2 protein in maize
本研究扩增编码AGPase大亚基多个基因之一的AGPL2基因，成功构建了原核表达载体PGEX-6T-1-AGPL2。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达GST-AGPL2蛋白，结果发现，在28 ℃、0.5 mmol/L IPTG条件下该蛋白能够得到高水平的表达。用亲和纯化的GST-AGPL2蛋白作为抗原，免疫新西兰大白兔成功制备其多克隆抗体，抗体具有较高的特异性和灵敏性。并利用AGPL2抗体初步研究了玉米AGPL2蛋白的时空表达分布，说明AGPL2蛋白主要存在于胚乳，其表达模式与淀粉积累规律一致，对进一步探索和研究植物中AGPL2蛋白、AGPase及淀粉的合成具有重要的意义。
兔多克隆抗体AGPL2具有较高的特异性和效价。在体外抗体特异性试验中，检测的总抗原蛋白500 ng，rTEV Protease去除GST标签前检测到了GST-AGPL2，而酶切后出现了不带标签的AGPL2及GST蛋白。结果表明，AGPL2多克隆抗体不但能识别AGPL2蛋白，而且也能识别GST。而在玉米体内不存在GST蛋白，因此，AGPL2多克隆抗体具有较高的特异性。在抗体效价方面，试验并未直接用Elisa实验去评估效价[18]，直接采用了Western Blot去验证抗体。因在抗原检测中，抗体的稀释比为1∶5 000，在体内玉米AGPL2蛋白检测试验中，也采用了1∶2 000的稀释比例。这些结果表明，AGPL2抗体具有较高的效价。另外，AGPL2抗体检测的总抗原蛋白为500 ng，其中AGPL2的量远低于500 ng，因此证明AGPL2抗体可用于检测纳克级蛋白，具有较高的特异性和灵敏性。总之，以上结果说明，试验获得了具有较高特异性和效价的抗体。
在多种植物中发现，AGPase的大小亚基不止一种基因编码，而是由多个基因编码，并且这些基因存在于不同的组织或器官，具有组织表达特异性[19-24]。本研究对玉米的根、茎、叶、种皮、胚、胚乳中的AGPL2亚基进行免疫杂交时，不同组织AGPL2蛋白的表达量不同，并且AGPL2在胚乳中表达量最高，表明了AGPL2亚基具有组织表达特异性且主要存在于胚乳。在黄斌全[25]的研究中，对胚乳、胚、根和叶中的AGPL2进行荧光定量，结果出现AGPL2在胚中的表达量最高，其次是叶，最低是根。与本研究的结果不一致，可能是因为本研究是基于蛋白水平，而黄斌全[25]是在RNA水平上进行研究的。有研究表明，RNA水平和蛋白水平往往不一致[26]。并对玉米不同授粉时期的胚乳裂解液进行Western Blot检测，检测到的信号强弱不一，且信号由弱到强再变弱，表明了玉米胚乳中AGPL2的表达模式是先增加后降低，这与黄斌全[25]研究的荧光定量结果一致，且与淀粉的积累规律相符。在玉米胚乳组织的表达分布中，AGPL2抗体在35，40 d主要识别了2条条带，推测由于大亚基蛋白同源性较高AGPL2抗体也可能识别AGPase的其他亚基。
[1] 尤 新. 玉米深加工技术[M]. 北京： 轻工业出版社，2011：5-15.
[2] Chen J，Yi Q，Cao Y，et al. ZmbZIP91 regulates expression of starch synthesis-related genes by binding to ACTCAT elements in their promoters[J]. Journal of Experimental Botany，2015，67(5)：1327-1338.
[3] Dinges J R，Colleoni C，Myers A M，et al. Molecular structure of three mutations at the maize sugary1 locus and their allele-specific phenotypic effects[J]. Plant Physiology，2001，125(3)：1406-1418.
[4] Huang B，Keeling P L，Hennen-Bierwagen T A，et al. Comparativein vitro analyses of recombinant maize starch synthases SSI，SSIIa，and SSIII reveal direct regulatory interactions and thermosensitivity[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2016，596：63-72.
[5] Cifuente J O，Comino N，Madariaga-Marcos J，et al. Structural basis of glycogen biosynthesis regulation in bacteria[J]. Structure，2016，24(9)：1613-1622.
[6] Rodriguez-L pez M，Baroja-Fern ndez E，Zandueta-Criado A，et al. Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase：A plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97(15)：8705-8710.
[7] Cross J M，Clancy M，Shaw J R，et al. Both subunits of ADP-glucose pyrophosphorylase are regulatory[J]. Plant Physiology，2004，135(1)：137-144.
[8] Stark D M，Timmerman K P，Barry G F，et al. Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADP glucose pyrophosphorylase[J]. Science，1992，258(5080)：287-292.
[9] Wang Z，Chen X，Wang J，et al. Increasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants[J]. Plant Cell，Tissueand Organ Culture，2007，88：83-92.
[10] Sakulsingharoj C，Choi S B，Hwang S K，et al. Engineering starch biosynthesis for increasing rice seed weight：the role of the cytoplasmic ADP-glucose pyrophosphorylase[J]. Plant Science，2004，167(6)：1323-1333.
[11] Batra R，Saripalli G，Mohan A，et al. Comparative analysis of AGPase genes and encoded proteins in eight monocots and three dicots with emphasis on wheat[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：19.
[12] Inukai T. Differential regulation of starch-synthetic gene expression in endosperm between indica and japonica rice cultivars[J]. Rice，2017，10(1)：7.
[13] Ishimaru T，Ida M，Hirose S，et al. Laser microdissection-based gene expression analysis in the aleurone layer and starchy endosperm of developing rice caryopses in the early storage phase[J]. Rice，2015，8(1)：57.
[14] Subasinghe R M，Liu F，Polack U C，et al. Multimeric states of starch phosphorylase determine protein-protein interactions with starch biosynthetic enzymes in amyloplasts[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2014，83：168-179.
[15] Giroux M J，Shaw J，Barry G，et al. A single mutation that increases maize seed weight[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93(12)：5824-5829.
[16] Smidansky E D，Clancy M，Meyer F D，et al. Enhanced ADP-glucose pyrophosphorylase activity in wheat endosperm increases seed yield[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99(3)：1724-1729.
[17] Smidansky E D，Martin J M，Hannah L C，et al. Seed yield and plant biomass increases in rice are conferred by deregulation of endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase[J]. Planta，2003，216(4)：656-664.
[18] 蒋佳颖，王一成，杨孝朴，等. 双抗体夹心ELIsA法测定猪d-干扰素的浓度[J]. 浙江农业学报，2015，27(5)：740-745.
[19] Burton R A，Jenner H，Carrangis L，et al. Starch granule initiation and growth are altered in barley mutants that lack isoamylase activity[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2002，31(1)：97-112.
[20] Giroux M J，Hannah L C. ADP-glucose pyrophosphorylase in shrunken-2 and brittle-2 mutants of maize[J]. Molecular & General Genetics，1994，243(4)：400-408.
[21] Lee S K，Hwang S K，Han M，et al. Identification of the ADP-glucose pyrophosphorylase isoforms essential for starch synthesis in the leaf and seed endosperm of rice (Oryza sativa L.) [J]. Plant Molecular Biology，2007，65(4)：531-546.
[22] Müller-Röber B T，Kossmann J，Hannah L C，et al. One of two different ADP-glucose pyrophosphorylase genes from potato responds strongly to elevated levels of sucrose[J]. Molecular & General Genetics，1990，224(1)：136-146.
[23] Nakata P A，Greene T W，Anderson J M，et al. Comparison of the primary sequences of two potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase subunits[J]. Plant Molecular Biology，1991，17(5)：1089-1093.
[24] Ohdan T，Francisco P B，Sawada T，et al. Expression profiling of genes involved in starch synthesis in sink and source organs of rice[J].Journal of Experimental Botany，2005，56(422)：3229-3244.
[25] 黄斌全.玉米淀粉合成关键酶：AGPase和isoamylase的功能研究[D].雅安：四川农业大学，2012.
[26] Walley J W，Shen Z，Sartor R，et al. Reconstruction of protein networks from an Atlas of maize seed proteotypes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110(49)：4808-4817.
余国武(1980-)，男，湖北荆门人，副教授，博士后，主要从事玉米淀粉合成调控研究。
黄玉碧(1963-)，男，四川南充人，教授，博士，主要从事玉米淀粉合成调控研究。