甜菜丛根病抗性差异性状及蛋白胶点鉴定比较研究

甜菜是重要的糖料作物，分布在东北、华北和西北三大片区。近年来甜菜种植面积逐渐增加，农民种植甜菜的经济效益也有所增加，但伴随甜菜种植面积的扩大，病害也有所加重。甜菜丛根病(BNYVV)是甜菜生产中的重要病害，能导致甜菜的严重减产和含糖率的降低，对农民和制糖企业都造成严重损失。防治丛根病的有效手段是栽种抗病品种，甜菜是2年生作物，育种周期较长，育种程序繁琐，繁育一个综合性状良好的抗病品种至少需要8-10年。近年来分子辅助育种发展迅速，分子标记、基因组学、转录组学、蛋白组学、基因工程日趋发展成熟，为育种家们提供了新的研究思路。将分子方法与常规育种结合起来能有效地加快育种进程，缩短育种年限，提高育种效率。

蛋白组学是从蛋白质角度入手，研究基因组所表达的全套蛋白质。随着蛋白质组学技术体系的不断发展、不断完善，各种植物蛋白质组学快速发展。甜菜作为重要的糖料作物，近年来其蛋白组学也有所发展。国外甜菜蛋白组学研究主要在芽势变化[1]、重金属胁迫[2]、抗旱性[3]、抗盐性[4]、育性[5]等方面有报道。国内相关学者也主要从育性、抗旱、产质量等方面进行了研究，其中曹洪祥[6]报道了对甜菜M14品系花器官进行特异性表达蛋白质的研究；牛佳[7]对甜菜细胞质雄性不育系与保持系花期差异蛋白表达开展了研究；李国龙等[8]开展了对甜菜叶片应答干旱胁迫处理进行的差异蛋白质组学分析；王雪峰[9]对甜菜块根膨大过程的蛋白组变化也进行了相关研究。此外，中国农业大学对BNYVV侵染系统寄主烟草和大果甜菜的生物学、转录组学和蛋白组学特点进行比较分析研究[10]。目前，关于甜菜蛋白质组学的报道相对于其他作物还是相对较少，特别是糖用甜菜与丛根病病原互作的蛋白水平变化研究尚未见正式报道，因此，本研究针对甜菜丛根病抗性开展一系列研究，对加快甜菜抗丛根病品种的培育工作有着重要的理论和实践意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料：抗病材料为病1(HB-1)、病2(N122)，感病材料为病5(HX-5)、病6(I-1)，均为内蒙古自治区农牧业科学院甜菜研究所自育材料，其中病1和病5为同一品系中选择的抗、感病材料，病2和病6为同一品系中选择的抗、感病材料，对照材料(CK)为KWS1197。

1.2 试验设计

盆栽试验：在自然条件下进行盆栽试验，病土为病圃地内二级病土，致病性极强，无病土取自4年以上非重茬的无病害健康土地。于2016年6月20日播种，实施地点为内蒙古农牧业科学院特色作物研究所。

水培试验：将盆栽长至第1片真叶展开后(苗龄15 d)的部分甜菜幼苗进行水培移栽，每天光照12 h，温度24 ℃，水培营养液用Hogland营养液。对水培材料用病土水进行浇灌，同时用伤根方法进行侵染。丛根病病毒检测取样部位为水培材料苗根部，总蛋白提取取样部位为苗叶片。实施地点为内蒙古农牧业科学院特色作物研究所光照组培室。

田间试验：实施地点设在内蒙古农牧业科学院丛根病病圃地，大田试验小区按照随机区组设计，小区行长5 m，小区宽1.1 m，行距55 cm，株距18 cm。每个材料播种2行，3个重复。于2016年5月4日播种，10月5日收获，进行测产检糖，8月20日进行田间发病调查，调查方法参照甜菜种质资源描述规范和数据标准。

1.3 试验方法

1.3.1 丛根病病毒浸染检测 RNA提取与纯化使用天根试剂盒，提取后样品溶于DEPC水中，-70 ℃储存备用，分光光度计在OD260和OD280条件下测定RNA含量和纯度。RT-PCR检测BNYVV[11]，扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。丛根病病毒检测所用正向引物序列为(5′-TTACCAGGTCCACGAAAG-3′)，反向引物序列为(5′-TGTTGAGGTCGGTGCTGA-3′)。

1.3.2 总蛋白提取总蛋白提取采用TCA/丙酮沉淀法[12]、可溶性蛋白提取法[13]和酚提取法[14]3种方法。

1.3.3 蛋白质浓度检测以水培材料病2为试验对象，胁迫处理前取样。检测方法：①从浓缩后的蛋白干粉中取15 mg，向其中加入150 μL的蛋白裂解液复融；②浓缩后的蛋白干粉很难溶解，可通过反

复冻融的方法促进蛋白溶解，直到看不见蛋白颗粒为止；③从上清液中取1 μL，稀释100倍，用于测定蛋白含量；④采用Bradford法[15]定量蛋白质，取6支试管，编号后，按表1加入试剂。

1.3.4 双向电泳及凝胶染色第一向等电聚焦采用水化上样的方法；第二向SDS-PAGE凝胶电泳采用12% SDS-PAGE凝胶垂直板电泳；凝胶染色采用经典考马斯亮蓝染色。表2为17 cm固相IPG胶条第一向等电聚焦设置的电泳程序。每个样品3次重复，用Image Master 2D Platinum Trial 5.0软件对凝胶进行检测及匹配分析。

1.3.5 LC-MS/MS(液质联用)分析蛋白质胶内酶解：①清洗脱色：考染胶用1 mL脱色液(50% 乙腈+25 mmol/L碳酸氢铵溶液)清洗多次，直至胶点脱色；②清洗后的胶点，加入500 μL乙腈脱水；③56 ℃条件下使用10 mmol/L DTT(二硫苏糖醇)处理胶点1 h，还原打开二硫键；④在暗室使用55 mmol/L IAM(碘乙酰胺)处理胶点45 min，进行半胱氨酸的烷基化封闭；⑤用1 μg/μL的胰蛋白酶溶液覆盖胶点；⑥冰上放置30 min后，补加25 mmol/L碳酸氢铵溶液至覆盖胶点，37 ℃消化过夜；⑦转移胶点外面存留的液体；⑧用50%乙腈从胶点中萃取肽段1次，再用100%乙腈萃取1次；⑨2次萃取的溶液和第7步的溶液合并，冷冻抽干。

LC-MS/MS上机：①将抽干后的肽段干粉离心；②用LC流动相的水相溶解干粉，振荡离心后取上清液上机；③LC设置：岛津LC-20AB泵，安捷伦ZORBAX SB_C18色谱柱，流速0.3 mL/min；④MS设置：LTQ OrbitrapVelos质谱，HESI源，正离子扫描模式，分辨率60 000，裂解方式CID。

蛋白质胶点鉴定主要是通过试验产生的质谱数据，与数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配，从而得到蛋白质鉴定结果。数据库的选择主要包括NCBI和The Beta vulgaris Resource数据库，蛋白质质谱分析由华大基因完成。

2 结果与分析

2.1 田间性状调查比较

2.1.1 苗期长势对盆栽试验材料进行对比可知，在苗期抗病材料的病土和健康土上存在着较大差异(图1)，生长势在病土要低于健康土，干物质含量在病土也要低于健康土，感病材料表现相同。

2.1.2 发病情况对病圃中甜菜生长后期发病情况进行调查，如图2所示，抗病材料发病情况明显低于感病材料。感病材料叶片萎蔫、叶脉变黄。图3为抗病材料和感病材料的正常植株与发病植株的叶片比较图，抗病材料表现良好，发病较轻。

2.1.3 产量与含糖测定对试验材料进行测产、检糖。试验数据如表3所示，对丛根病具有抗性的材料病1、病2每公顷产糖量均极显著高于对照，较对照分别提高8.50%和20.26%。每公顷块根产量病1略低于对照，病2高于对照4.47%，病2较病1表现更好。感病材料病5、病6每公顷块根产量和产糖量均极显著低于对照，每公顷块根产量分别较对照低27.48%和33.44%，每公顷产糖量较对照低32.47%和37.24%。感病材料较抗病材料田间性状表现明显较差。

2.2 丛根病毒检测

以盆栽结合水培的模式对丛根病抗病材料与感病材料进行病毒侵染处理，并利用RT-PCR检测BNYVV病毒(图4)。以甜菜无菌组培植株作为阴性对照，以甜菜病圃发病植株作为阳性对照，经反转录PCR凝胶电泳显示，病毒胁迫处理前后，与阳性对照相比较，侵染材料均出现特异性条带，并且随着侵染时期的延长病毒浓度增加，证实病土水浇灌处理后，试验材料被侵染，含有甜菜黄脉坏死病毒。

2.3 蛋白质提取方法比较及浓度检测

采用3种总蛋白提取方法进行垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图5)，在上样量均为15 μL的情况下，TCA/丙酮法提取条带最清晰，效果最好。酚提取法较之颜色稍浅，可溶性蛋白提取法条带最浅。Bradford法定量蛋白质，试验测得提取的蛋白质检测吸光值为0.848，通过与标准曲线(图6)比对，蛋白质浓度约为75.50 mg/L，符合双向电泳要求。

2.4 蛋白质胶点检测及LC-MS/MS(液质联用)分析

双向电泳后利用Image Master 2D Platinum Trial 5.0对病1、病5以及病2、病6进行蛋白质胶点检测及匹配分析(表5)，其中病1共检测到338个蛋白点，病5检测到284个蛋白点，病2检测到314个蛋白点，病6检测到285个蛋白点。双向电泳每个样品重复3次，通过匹配分析及投射光观察扣除差异蛋白点共计78个。其中病2扣除蛋白点40个，病1扣除21个，病5扣除14个，病6扣除3个。

将扣除的具有明显差异的蛋白点78个送华大基因进行蛋白质质谱分析。病2和病6之间检测到的蛋白质中28个样品为肽段支持数大于等于1的显著性结果，其中23个样品为肽段支持数大于等于2的显著性结果；病1和病5之间检测到的蛋白质中34个样品为肽段支持数大于等于1的显著性结果，其中24个样品为肽段支持数大于等于2的显著性结果。最终选肽段支持数大于2(抛除重复的)的显著性结果，总共鉴定有效蛋白质ID为34个。表6为部分甜菜差异蛋白点MALDI-TOF-TOF/MS鉴定结果。

对有效蛋白ID通过NCBI和The Beta vulgaris Resource数据库Blast比对。这些蛋白质序列均能和The Beta vulgaris Resource数据库中的序列比对上，NCBI比对能检测到大部分同源序列。比对结果显示相关差异蛋白主要是光合作用、糖代谢、呼吸抗氧化作用、信号转导、脂代谢及一些未知蛋白质。其中光合作用蛋白包括景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶、叶绿素a/b结合蛋白、光系统Ⅱ相关蛋白、叶绿体的茎环结合蛋白，糖代谢相关蛋白包括内切β-甘露糖苷酶、5-核糖-磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶，呼吸作用蛋白包括氧增强蛋白、核酮糖二磷酸羧化/加氧酶活化酶，信号转导蛋白包括叶绿体未知AARF域包含蛋白激酶at1g79600、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、核孔复合体蛋白、腺嘌呤磷酸核糖转移酶，脂代谢蛋白包括可溶性无机焦磷酸酶、半胱氨酸甲基转移酶。病1和病2主要表达的功能蛋白以光合作用、糖代谢、呼吸抗氧化作用、信号转导、脂代谢及一些未知蛋白质为主，而病5和病6主要表达光合作用蛋白和呼吸抗氧化蛋白，即自身应激反应所表达的蛋白质。

3 结论与讨论

甜菜丛根病抗性一直以来都是甜菜育种工作者研究的重点内容，我国20世纪90年代末筛选出对丛根病具有抗性的育种材料，但对于其抗性机理并没有研究透彻。中国农业大学相关研究人员对丛根病病毒的类型进行了研究[10，16]。国内其他关于丛根病相关的报道也大多是从病毒及抗性酶方面进行研究。本研究首次针对内蒙古农牧业科学院自育的抗/感病材料，对具有丛根病抗性的材料进行田间表型鉴定，验证了育种材料中含有丛根病抗性资源，为育种工作者选育丛根病抗性材料提供了相应的理论依据。

蛋白组学是近年发展起来的研究方法，近年来在其他植物上发展迅速，如水稻[17]、大豆[18]、小麦[19]、油菜[20]、甘蔗[21]、木薯[22]等。本研究对甜菜丛根病病毒侵染后的抗病感病材料在蛋白质水平进行了比较分析，发现抗性材料较感病材料检测到的蛋白质点更多一些，说明有一些特异性蛋白质表达，其中有些蛋白质表达上调。说明抗病材料在抗病机理上与感病材料有所不同。质谱分析后通过NCBI和和The Beta vulgaris Resource数据库进行Blast比对，这些蛋白质序列均能和The Beta vulgaris Resource数据库中的序列比对上。这些表达的功能蛋白以光合作用、糖代谢、呼吸抗氧化作用、信号转导、脂代谢及一些未知蛋白质为主。这与植物对逆境的应激生理反应是基本一致的。在甜菜与BNYVV互作的过程中，发现了许多光合作用和能量相关蛋白的表达，包括核糖二磷酸酶、叶绿素a/b结合蛋白、光系统反应中心亚基、ATP酶等。植物在逆境期间对能量资源的管理通常是为了提供防御所需的能量，并且在某些兼容的病毒/宿主相互作用中，预测到参与光合作用的蛋白质很可能被病毒本身激活，从而产生病毒复制所需的代谢能量[23]。植物的初级代谢包括所有对植物的生存、生长和发育至关重要的代谢途径。相比之下，次级代谢产物是在其他代谢途径中产生的化合物，尽管这些代谢途径很重要，但对植物的功能并不重要；然而，这些蛋白质中的许多在植物防御中是重要的。信号转导通路是在单个细胞内部和整个植物内传递信息的信号转导通路，在细胞水平上一旦受到生物或非生物胁迫，就会被激活，从而导致植物的许多途径和细胞过程发生变化。在BNYVV感染过程中，有几种蛋白被表达，这些蛋白被预测与信号转导和转运有关。钙调素是一种被广泛研究的蛋白质，在植物细胞信号传递和调控许多目标蛋白方面发挥着重要作用[24]。已鉴定的几种感兴趣的蛋白质，之前据报道它们与植物的防御反应或植物对其他刺激的反应有关，主要包括：内切酶、葡萄糖苷酶、过氧化物酶。这些可能与植物对病毒的敏感性有关。

[1] Catusse J，Meinhard J，Job C，et al. Proteomics reveals potential biomarkers of seed vigor in sugarbeet[J]. Proteomics，2011，11(9)：1569-1580.

[2] Gutierrez-Carbonell E，Lattanzio G，Sagardoy R，et al. Changes induced by zinc toxicity in the 2-DE protein profile of sugar beet roots [J]. Journal of Proteomics，2013，94：149-161.

[3] Hajheidari M，Abdollahian-Noghabi M，Askari H，et al. Proteome analysis of sugar beet leaves under drought stress[J]. Proteomics，2005，5(4)：950-960.

[4] Yu B，Li J N，Koh J，et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of sugar beet monosomic addition line M14 in response to salt stress[J]. Journal of Proteomics，2016，143：286-297.

[5] Wesolowski W，Szklarczyk M，Szalonek M A. Analysis of the mitochondrial proteome in cytoplasmic male-sterile and male-fertile beets[J]. Journal of Proteomics，2015，119：61-74.

[6] 曹洪祥. 甜菜M14品系花器官特异表达蛋白质的研究[D]. 哈尔滨：黑龙江大学，2009.

[7] 牛佳. 甜菜细胞质雄性不育系及其保持系花期蛋白差异表达分析[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2013.

[8] 李国龙，吴海霞，孙亚卿，等. 甜菜叶片应答干旱胁迫的差异蛋白质组学分析[J]. 作物杂志，2015(5)：63-68.

[9] 王雪峰. 基于iTRAQ技术对甜菜块根膨大蛋白质组学的研究[D]. 呼和浩特：内蒙古农业大学，2016.

[10] 范慧艳.甜菜坏死黄脉病毒侵染本生烟和大果甜菜的生物学、转录组学和蛋白质组学研究[D].北京：中国农业大学，2014.

[11] 刘大丽，马龙彪，王晳玮，等. 应用RT-PCR技术检测甜菜坏死黄脉病毒[J]. 中国糖料，2008(2)：12-14.

[12] 任燕，陈暄，房婉萍，等. 茶树雌蕊总蛋白质双向电泳分离体系的建立[J]. 茶叶科学，2013，33(5)：420-428.

[13] 石海波，王云生，冯勇，等. 玉米籽粒蛋白质双向电泳技术体系的优化[J]. 华北农学报，2015，30(1)：171-176.

[14] Sarma A D，Oehrle N W，Emerich D W. Plant protein isolation and stabilization for enhanced resolution of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Analytical Biochemistry，2008，379(2)：192-195.

[15] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[16] 刘涛，韩成贵，李大伟，等. 甜菜坏死黄脉病毒RNA5对病毒致病性的影响[J]. 科学通报，2003，48(5)：464-467.

[17] Mu Q L，Zhang W Y，Zhang Y B，et al. iTRAQ-Based quantitative proteomics analysis on rice anther responding to high temperature[J]. International Journal of Molecular Sciences，2017，18(9)：1-12.

[18] 牛宁，李占军，金素娟，等. 大豆蛋白质组学研究进展[J]. 中国油料作物学报，2014，36(5)：667-675.

[19] 梁银萍，常小丽，张敏，等. 小麦L699叶片受白粉菌胁迫后蛋白质的差异表达[J]. 麦类作物学报，2016，36(4)：460-464.

[20] 檀龙颜. 油菜种子萌发响应胁迫的生理学与蛋白质组学研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2014.

[21] Thanh-Trung T，李健，张风娟，等. 甘蔗与抗旱性相关差异蛋白质组分析[J]. 作物学报，2017，43(9)：1337-1346.

[22] 邓昌哲，姚慧，安飞飞，等. 木薯块根有色体分离及其蛋白质组学的研究[J]. 作物学报，2017，43(9)：1290-1299.

[23] Di Carli M，Benvenuto E，Donini M. Recent insights into Plant-Virus interactions through proteomic analysis[J]. Journal of Proteome Research，2012，11(10)：4765-4780.

[24] Ranty B，Alson D，Galaud J P. Plant calmodulins and calmodulin-related proteins[J]. Plant Signaling and Behavior，2006，1(3)：96-104.