干旱是世界性的自然灾害之一，干旱会导致粮食作物和蔬菜减产，甚至绝收，造成巨大的经济损失。因此，提高农作物抗旱性是国内外许多学者一直在研究的重要课题[1]。黄瓜(Cucumis sativus L.)作为一种日常食用的蔬菜作物，每年的消费量很大，但由于黄瓜根系浅(多分布在30 cm以内的土层中)、喜湿、抗旱能力较差，提高黄瓜对干旱胁迫的适应性已成为蔬菜栽培领域亟待解决的重要问题之一 [2]。
一氧化碳(Carbon monoxide，CO)是继一氧化氮之后被发现的又一气体信号分子，它参与种子萌发、休眠、气孔关闭等多种植物生理生化过程[3]，是植物应对各种非生物胁迫的有效抗氧化剂，能够有效缓解胁迫条件下自由基对植株造成的氧化损伤[4]。有研究表明，CO能够提高黄连幼苗对盐胁迫的抗性[5]，参与干旱胁迫下苜蓿种子萌发的调控[6]，还能够与氢气共同调节干旱胁迫下黄瓜不定根的发育[1]。此外，CO还可以与NO、H2O2等信号分子协同作用，通过共同介导的细胞信号转导过程，发挥生物学效应，应对各种胁迫对植物造成的伤害[3]。但外源CO对干旱胁迫条件下黄瓜萌发生长缓解效应的研究迄今尚未见报道。本试验以萌发的黄瓜种子为试验材料，从养分吸收能力、质膜稳定性、渗透调节能力和水解酶的活性及其同工酶表达水平等角度，探讨外源CO抵抗黄瓜干旱胁迫的作用效果与机理，以期为CO作为抗旱诱导剂在黄瓜优质、高效栽培中的应用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料与培养
新津研四号黄瓜种子购于天津市中天种业有限公司。将种子用0.1%的氯化汞浸泡消毒10 min，然后用蒸馏水漂洗6次，晾干。把晾干后种子分成2份，一份用蒸馏水，另一份用0.01 μmol/L高铁血红素溶液(CO的供体)在25 ℃下浸泡8 h，然后将种子转移到垫有2层滤纸的培养皿中，每皿放20粒种子，分别向皿中加入蒸馏水或质量分数10% 的PEG6000溶液，置于25 ℃恒温培养箱中培养，每天定时更换相应的处理液。
1.2 试验设计
试验设4个处理，所有处理重复3次，每个重复5皿。各处理分别为：对照组(CK).蒸馏水浸种，蒸馏水培养；PEG.蒸馏水浸种，10%PEG培养；CO.高铁血红素浸种，蒸馏水培养；PEG+ CO.高铁血红素浸种，10% PEG培养。在种子处理的第2天测定发芽势，第3天测定发芽率，第4天测定生理、生化指标，第6天测量根长、胚轴长及鲜质量。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 生长指标 以露白长度≥1 /2 种子长度作为发芽标准，计算黄瓜种子的发芽势和发芽率。
每皿随机选取10株，用直尺测量根长和胚轴长；用蒸馏水冲洗3遍，滤纸吸干表面水分，用电子天平精确称量鲜质量。
发芽势=第2天发芽种子数/种子总数×100%；发芽率=第3天发芽种子数/种子总数×100%。
1.3.2 种子吸胀的测定 种子吸胀的测定采用碘-碘化钾法[7]。向每个处理加入处理液总体积2%的碘/碘化钾溶液(0.6% 碘和6%碘化钾)，培养24 h，拍照记录种子颜色与体积大小。由于种子吸胀，碘试剂会进入种子内部，与淀粉发生显色反应，因此，种子的体积大小与颜色深浅代表种子的吸胀程度。
1.3.3 根质膜透性测定 根质膜透性的测定采用伊文思蓝染色法[8]。先用0.5 mmol/L的氯化钙溶液将各处理的根洗净，用滤纸吸干表面水分，置于伊文思蓝染液(pH值5.6，含0.025%的伊文思蓝，0.5 mmol/L的氯化钙)中浸泡，10 min后取出，用0.5 mmol/L的氯化钙溶液漂洗多次，再次用滤纸吸干表面水分，用相机拍照记录结果。
1.3.4 水解酶活性测定 淀粉酶活性和酯酶活性的测定分别采用3，5-二硝基水杨酸显色法[9]和固兰B盐显色法[10]。
1.3.5 水解酶同工酶电泳 称取不同处理的黄瓜种子各1.0 g，置于预冷的研钵中，加入5 mL 50 mmol/L pH值7.8的磷酸盐缓冲液(含5 mmol/L的β-巯基乙醇和2%聚乙烯吡咯烷酮)和少量的石英砂于冰浴研磨， 4 ℃条件下离心(10 000 r/min)30 min，上清液即为水解酶提取液。
水解酶的同工酶电泳参照Zhang等[11]的方法进行。分离胶浓度10%，浓缩胶浓度4%。其中，淀粉酶同工酶电泳用碘-碘化钾溶液染色，酯酶同工酶电泳用醋酸萘脂-固蓝B盐染色。
1.3.6 其他生理指标的测定 丙二醛(MDA)含量的测定参照Hannachi等[12]的方法进行；根系活力及可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定分别采用氯化三苯基四氮唑( TTC )法、蒽酮比色法和考马斯亮蓝G-250染色法，具体参照李合生等[13]的方法。
1. 4 数据统计分析
所有试验重复3次，采用SPSS 19.0和Origin 8.6软件对试验数据进行统计分析和制图；用Tukey法判断试验结果的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 外源CO对黄瓜种子萌发生长的影响
发芽势、发芽率和发芽后的根长、胚轴长及鲜质量是反映黄瓜生长状况的重要指标。从表1 可以看出，与对照组CK相比，PEG胁迫组的5个生长指标均显著降低(P<0.05)，表明干旱胁迫严重抑制了黄瓜种子的萌发生长；CO处理组与CK间无明显差异，PEG+CO处理组的5个生长指标虽显著低于CK(P<0.05)，但显著高于PEG胁迫组(P<0.05)，表明外源CO对干旱胁迫下黄瓜种子的萌发生长有显著的促进作用。
表1 外源CO对干旱胁迫下黄瓜种子萌发生长的影响
Tab.1 Effects of CO on the germination and growth of cucumber seeds under drought stress
处理Treatment发芽势/%Germination energy发芽率/%Germination rate根长/cmRoot length 胚轴长/cmHypocotyl length 鲜质量/gFresh weightCK67.35±2.17a77.27±3.68a5.26±0.13a4.22±0.19a0.29±0.005aPEG19.79±1.16c44.09±3.25c3.32±0.10c1.31±0.15c0.14±0.003cCO65.52±2.46a82.17±4.24a5.46±0.26a3.98±0.26a0.28±0.004aPEG+CO52.36±2.29b60.51±3.79b4.42±0.34b2.32±0.34b0.20±0.003b
注： 数据为3次测量的平均值±标准差；同列不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。
Note：Data are shown as means ±standard deviation (n=3)； Different lowercase letters in the same column indicate significantly Different (P<0.05).
2.2 外源CO对黄瓜种子养分吸收能力的影响
通常情况下，吸胀是植物种子萌发的前提，干旱胁迫会限制种子吸胀，从而阻碍种子萌发[14]。从图1-A的黄瓜种子吸胀试验结果可以看出，PEG处理组的黄瓜种子体积明显小于CK，颜色也较CK浅，说明干旱胁迫抑制了种子的吸胀；CO处理组的黄瓜种子体积及颜色深浅与CK相似，无明显差异；而PEG+CO处理组的黄瓜种子的体积与着色程度均明显优于PEG处理，表明外源CO有利于干旱胁迫下黄瓜种子的吸水膨胀，促进黄瓜种子对水分的吸收与利用。
根系活力泛指根系的吸收、合成和氧化还原能力等，是反映根系生命力的综合生理指标[15]。从图1-B可以看出：与CK相比，PEG胁迫组黄瓜种子的根系活力(以鲜质量计)显著下降(P<0.05)，单独CO处理组的根系活力较CK显著提高(P<0.05)，而PEG+CO处理组的根系活力尽管也显著下降，但比PEG胁迫组提高了12.57%，表明外源CO处理可以缓解干旱胁迫对黄瓜根系的伤害，提高黄瓜根系对养分的吸收能力。
图1 外源CO对干旱胁迫下黄瓜种子吸胀(A)和根系活力(B)的影响
Fig.1 Effect of exogenous CO on the cucumber seeds imbibition (A) and root activity (B) under drought stress
2.3 外源CO 对黄瓜种子质膜稳定性的影响
大量研究表明，干旱胁迫可破坏质膜的完整性，导致质膜的透性增大，甚至导致细胞死亡。同时干旱诱导的膜脂过氧化也是造成植物细胞膜受到损伤的关键因素之一[16-18]。利用伊文思蓝对黄瓜的根系进行染色可以反映黄瓜根系的质膜完整性，因为根系的染料着色程度与质膜透性呈正相关[19]。而MDA含量则是反映植物膜脂过氧化的水平和细胞膜损伤程度的重要指标。
从图2-A可以看出，与对照组CK相比，PEG处理的根尖颜色明显加深，说明干旱胁迫明显增加了黄瓜根尖的质膜透性；CO处理的根尖着色与CK差别不明显，而PEG+CO处理的根尖着色略深于对照组，但明显浅于PEG胁迫组，说明外源CO处理可抑制干旱胁迫导致的根质膜损伤。从图2-B可以看出，PEG处理组的MDA(以鲜质量计)含量最高，而PEG+CO处理组MDA含量虽显著高于对照组，但远低于PEG处理组，比PEG胁迫组降低了25.81%。这表明，外源CO处理能够有效地降低细胞膜脂过氧化水平，减轻干旱胁迫对黄瓜根系造成的氧化损伤。
图2 外源CO对干旱胁迫下黄瓜种子质膜透性(A)和MDA含量(B)的影响
Fig.2 Effects of exogenous CO on the plasma membrane permeability (A) and MDA content (B) of cucumber seeds under drought stress
2.4 外源CO 对黄瓜种子渗透调节能力的影响
渗透调节是植物适应渗透胁迫伤害的一种应急反应，通过主动增加细胞内溶质，降低渗透势以促进细胞吸水从而维持细胞膨压[20]。可溶性糖和可溶性蛋白是植物细胞内重要的渗透调节物质，它们可以缓解渗透胁迫对植株造成的损伤。从图3可以看出，PEG胁迫组的可溶性糖和可溶性蛋白含量(以鲜质量计)均比对照组显著增加(P<0.05)，表明黄瓜种子自身对干旱胁迫伤害做出了响应；CO处理组的可溶性糖和可溶性蛋白含量均显著高于对照组(P <0.05)，PEG+CO处理组的可溶性糖和可溶性蛋白含量分别比PEG胁迫组提高了32.56%和5.84%，表明施用外源CO可以改善黄瓜种子的渗透调节，提高黄瓜种子对干旱胁迫的适应性。
图3 外源CO对干旱胁迫下黄瓜种子可溶性糖(A)和可溶性蛋白(B)含量的影响
Fig.3 Effects of exogenous CO on the contents of soluble sugar (A) and soluble protein (B) in cucumber seeds under drought stress
2.5 外源CO 对黄瓜种子水解酶活性及其同工酶表达的影响
在黄瓜种子萌发的过程中，体内积累的淀粉会在淀粉酶的作用下，被降解并以蔗糖的形式转运到胚芽和胚根中，为种子萌芽和生长提供能量和物质基础[21]。因此，淀粉酶对黄瓜种子的萌发起着非常重要的作用。从图4-A可以看出，与CK相比，其他各处理均能显著提高黄瓜种子的淀粉酶的活性(P<0.05)，但以PEG+ CO处理组增加幅度最大，比对照组提高了27.45%，比PEG组提高了9.87%。从图4-B可以看出，对照组CK的淀粉酶同工酶有2条较弱的条带，PEG胁迫组增加了1条条带，且各条带的亮度较对照组明显增强，CO处理组和PEG+CO处理组的淀粉酶同工酶条带均比对照组增加了2条，但PEG+CO处理组条带的宽度和亮度均高于其他处理组。这些结果表明，黄瓜种子自身可以通过增强淀粉酶活性，促进淀粉酶同工酶的表达来对干旱胁迫做出响应，而外源CO能够在此基础上进一步提高其淀粉酶的活性，诱导新的同工酶表达，以提升黄瓜种子对干旱胁迫的抗性。
酯酶作为一种水解酶，同淀粉酶一样，在植物种子萌发过程中也发挥着非常重要的作用。由图4-C可知，不同处理的酯酶活性变化趋势与淀粉酶相似，即各处理均能显著提高黄瓜种子的酯酶的活性(P<0.05)，但以PEG+CO处理活性最强，比对照组提高了58.91%，比PEG组提高了48.87%。从图4-D的酯酶同工酶电泳检测结果可以看出，不同处理的黄瓜种子的酯酶同工酶均有6条条带，条带颜色深度的大小排序为：PEG+CO>CO>PEG>CK。上述结果表明，单独的PEG或CO处理均可诱导黄瓜酯酶活性的增强及酯酶同工酶的表达，但以PEG+CO的作用效果最佳。即外源CO能在黄瓜种子自身响应干旱胁迫的基础上通过进一步提高酯酶活性，增强酯酶同工酶的表达，来缓解黄瓜种子在干旱胁迫下所受的伤害。
A.淀粉酶活性；B.淀粉酶同工酶谱；C.酯酶活性； D.酯酶同工酶谱。 A.Amylase activity；B.Amylase isoenzyme patterns；C.Esterase activity；D.Esterase isoenzyme patterns.
图4 外源CO对干旱胁迫下黄瓜种子水解酶的影响
Fig.4 Effects of exogenous CO on the hydrolase of cucumber seedlings under drought stress
3 讨论
CO作为重要的气体信号分子，在植物生命活动中的作用受到越来越多的关注。随着研究的不断深入，人们发现 CO在多种非生物胁迫条件下均能发挥重要作用，能够缓解逆境对植物体的伤害，提高植物对逆境的抗性[3]。本试验研究了CO对干旱胁迫下黄瓜种子萌发生长的影响，结果表明，干旱胁迫下，外源CO处理对黄瓜种子的萌发生长有明显的促进作用，这与Chen等[1]的研究结果一致。
自然界大多数植物的种子，不吸水膨胀就不能萌发，种子的吸胀是萌发的前提。本试验中，PEG胁迫处理对黄瓜种子吸胀表现出明显的抑制作用，而PEG+CO处理较PEG胁迫处理表现出显著的缓解效应，说明外源CO有助于干旱胁迫条件下黄瓜种子对水分的吸收利用。根系活力是植物对养分吸收能力的一个重要指标，根系活力的大小直接影响植物地上部分的生长和营养状况[22]。本研究中，外源CO处理对黄瓜正常生理及PEG胁迫下的根系活力的提高均有显著的促进作用，表明外源CO可以提高黄瓜种子对养分的吸收能力，这可能是外源CO提高黄瓜种子对干旱胁迫适应性的一个关键因素。
在干旱胁迫条件下，植物体内会发生一系列生理生化变化，一方面，会产生大量活性氧，造成膜脂过氧化损伤，产生丙二醛，使植物细胞膜系统受到破坏；另一方面，细胞渗透势增加，膨压加大，细胞会发生被动脱水。与此同时，植物自身也会对逆境条件做出积极响应，以应对干旱胁迫[23]。本研究中，PEG胁迫处理，导致了黄瓜种子质膜透性增大，MDA大量积累，说明胁迫对黄瓜的细胞膜系统造成了严重的损伤。PEG胁迫处理的黄瓜种子中的可溶性糖和可溶性蛋白的含量均较对照组显著提高，这是黄瓜种子对干旱逆境的响应。与PEG胁迫处理相比，PEG+CO处理的根质膜透性和MDA含量均明显降低，可溶性糖和可溶性蛋白的含量均显著升高，表明外源CO可以抑制膜质过氧化损伤，维持逆境下细胞膜系统的稳定性，并改善渗透调节能力，这可能是外源CO增加黄瓜抗旱能力的重要环节。
植物种子萌发的初始阶段所需要的能量主要来源于贮存物质(淀粉、脂类等) 的氧化分解，而这一代谢过程主要由淀粉酶和酯酶来催化完成。本研究中，PEG胁迫组的淀粉酶和酯酶的活性及其同工酶表达水平均较对照组显著升高，这是黄瓜种子对干旱胁迫应激反应的表现；CO处理的淀粉酶和酯酶的活性及其同工酶表达水平显著优于对照组，PEG+CO处理组的淀粉酶和酯酶的活性及其同工酶表达水平显著优于PEG胁迫组，表明外源CO能够通过提升黄瓜种子水解酶的活性，增强水解酶同工酶的表达水平，来有效保证黄瓜种子萌发期间的营养供应，这可能是外源CO缓解黄瓜干旱胁迫的又一重要机制。
综上所述，外源CO 可以通过提高干旱胁迫下黄瓜种子对养分的吸收能力、维持细胞膜系统的稳定性、改善渗透调节能力、提升淀粉酶和酯酶的活性及其同工酶的表达水平来增强其对干旱胁迫的适应性，进而促进了胁迫条件下黄瓜种子的萌发生长。
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