血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)属于腺病毒科禽腺病毒属禽腺病毒C种[1]。FAdV-C血清4型强毒株对雏鸡的致病能力较强，可以垂直传播和水平传播。FAdV-4可致鸡发生心包积水综合征(Hydro pericardium syndrome，HPS)，该病在全世界分布广泛，以心包囊中积聚透明或淡黄的液体为主要特征，发病鸡常表现为食欲不振、贫血、羽毛粗乱、鸡冠颜色变浅、嗜睡等，死亡率高达30%～90%。心包积液综合征最早发生在巴基斯坦的安卡拉地区，因此，也叫“安卡拉”病，随后墨西哥、加拿大、日本、澳大利亚等国家相继暴发了该病。1976年，我国台湾报道了该病，随后在辽宁、吉林、湖南、江苏和河南等省也相继发生该病[1-5]。目前，该病已经成为一种严重危害我国养禽业发展的传染病。
FAdV是无囊膜的双股DNA病毒，呈二十面体对称，由蛋白衣壳、核心蛋白和DNA组成。蛋白衣壳由五邻体(Peton)、六邻体(Hexon)和纤突(Fiber)3种主要的蛋白构成。六邻体含量最高，是病毒粒子中最大的蛋白，在各种腺病毒具有很高的同源性。六邻体具有群、亚群、型特异抗原决定簇，是中和抗体的靶标。因此，研究六邻体蛋白的特性和功能，将为腺病毒引起疾病的诊断与防治提供重要的理论依据[3-8]。
本研究克隆并表达了FAdV-4的六邻体蛋白，利用大肠杆菌表达系统获得了重组蛋白的大量表达，通过Western Blot对其反应原性进行鉴定，旨在为进一步研究血清4型禽腺病毒和心包积水综合征的防治奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
大肠杆菌BL21、质粒pET-32a、FAdV-4肝毒，为江苏省农业科学院禽病与生物制药研究室保存；PMD18-T、Ex-Taq聚合酶、SolutionⅠ快速连接酶、大肠杆菌DH5α、DNA限制性核酸内切酶、DNA Marker购自TaKaRa公司；引物片段由南京金斯瑞生物科技公司合成；DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒，购自美国Axygen公司；HIS标签抗体、碱性磷酸酯酶标记山羊抗小鼠IgG、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒，购自碧云天生物技术研究所；其他试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 引物设计与合成
根据GenBank上序列号为NC-015323的腺病毒hexon基因序列，应用引物设计软件Primer 5.0 设计2段引物，引入酶切位点，上游引物(5′-TCGCGAATTCATGGCGGCCCTCACG-3′，引入EcoR Ⅰ酶切位点及保护性碱基)、下游引物(5′-CTCTAAGCTTTTACACGGCGTTGCCTG-3′，引入Hind Ⅲ 酶切位点及保护性碱基)，由金斯瑞生物科技公司合成。
1.3 hexon基因的扩增与克隆
以FAdV-4肝毒提取的cDNA为模板，用Taq酶进行PCR扩增。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸2 min 30 s， 30个循环；72 ℃ 延伸7 min。扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，用凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。PCR回收产物克隆至pMD-18T，转化至E.coli DH5α感受态，经PCR鉴定和测序分析获得pMD-18T-hexon重组质粒。
1.4 表达载体的构建与鉴定
将构建的pMD-18T-hexon质粒和pET-32a载体同时用EcoRⅠ和Hind Ⅲ 双酶切。双酶切后的hexon基因片段和pET-32a载体分别纯化回收，经SolutionⅠ快速连接，转化至E.coli DH5α感受态，经氨苄抗性培养基筛选，挑取阳性克隆振荡培养，提取质粒，进行双酶切鉴定，测序分析获得pET-32a-hexon重组质粒。
1.5 pET-32a-hexon融合蛋白的诱导表达鉴定
将重组质粒pET-32a-hexon转化至E.coli BL21，挑取单个菌落进行扩增，当细胞培养至OD600nm约为0.7 h，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，采用不同诱导时间进行诱导表达，比较不同诱导条件的表达量，确定最佳诱导条件，同时设立pET-32a空载体的表达菌作为空白对照。最后将各时间段菌液收集离心，用PBS重悬沉淀，加入上样缓冲液，煮沸5 min，离心上样，进行SDS-PAGE电泳分析。
1.6 pET-32a-hexon融合蛋白的可溶性分析
取菌液以1∶100的体积比扩大培养，采用优化的表达条件(37 ℃，3 h)进行大量表达，表达完毕后收集菌体，用PBS重悬菌体沉淀并超声破碎，破碎完毕后，4 ℃ 12 000 r/min，离心10 min，分别收集上清和沉淀，加入上样缓冲明液，煮沸5 min，离心进行SDS-PAGE电泳鉴定。
1.7 pET-32a-hexon融合蛋白的Western Blot鉴定
融合蛋白经SDS-PAGE分离后，采用湿法将蛋白转印至硝酸纤维膜(NC膜)上，然后70 V电压作用40 min； 5%BSA，4 ℃封闭过夜，经PBST(0.05%Tween-20)洗涤后分别加入HIS标签抗体和hexon阳性血清，37 ℃孵育1 h；再以PBST(0.05%Tween-20)洗涤，加入碱性磷酸酯酶标记的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBST(0.05% Tween-20)洗涤，按照BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒说明进行显色处理。
2 结果与分析
2.1 重组表达质粒pET-32a-hexon双酶切鉴定及测序结果
提取重组质粒pET-32a-hexon，以EcoRⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到与预期大小相符的2个片段(图1)，其中小片段为2 800 bp左右；南京金斯瑞生物公司测序结果显示，插入片段hexon基因大小为2 814 bp，且序列正确，表明目的片段已连接到载体pET-32a上，并成功筛选出阳性菌落。
M.DL2000 DNA Marker；1.EcoRⅠ+Hind Ⅲ双酶切。 M.DL2000 DNA Marker；1. EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ double enzyme digestion.
图1 重组表达质粒pET-32a-hexon双酶切鉴定结果
Fig.1 Double enzyme digestion of recombinant plasmid pET-32a-hexon
2.2 重组蛋白诱导表达与SDS-PAGE分析结果
从SDS-PAGE分析结果可看出，重组菌BL21(pET-32a-hexon)在1 mmol/L IPTG的诱导下，随着诱导时间的增加，重组蛋白表达量先增加后减少，诱导时间为3 h时，蛋白表达量最高(图2)。重组菌得到了表达，分子量大小在118 ku左右，与预期结果相符。
M.蛋白分子量Marker；1.pET-32a空载体；2-8.分别为诱导 后0，1，2，3，4，5，6 h表达的蛋白。 M.Protein Marker；1.Control of vector pET-32a；2-8.Induced pET-32a-hexon for 0，1，2，3，4，5，6 h.
图2 pET-32a-hexon 重组蛋白的SDS-PAGE检测
Fig.2 Analysis of pET-32a-hexon fusion protein by SDS-PAGE
2.3 重组蛋白在菌体中的表达形式
重组菌经1 mmol/L IPTG诱导，37 ℃诱导3 h后，收集菌体，以PBS重悬，超声裂解，进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明，沉淀包涵体在118 ku处条带单一且明显，说明表达产物主要是以包涵体形式存在于沉淀中(图3)。
M.蛋白分子量Marker；1.pET-32a空载体；2.诱导后3 h表达的全菌蛋白；3.重组质粒诱导后的上清产物；4.重组质粒诱导后的包涵体产物。
M. Protein Marker；1.Control of vector pET-32a；2.Induced pET-32a-hexon for 3 h;3.The inclusion bodiesinduced by recombinant plasmid；4.The supernatant product induced by recombinant plasmid.
图3 pET-32a-hexon 重组蛋白的 可溶性分析SDS-PAGE检测
Fig.3 Soluble analysis of pET-32a-hexon fusion protein by SDS-PAGE
2.4 重组蛋白的Western Blot鉴定
诱导表达的重组pET-32a-hexon蛋白经SDS-PAGE电泳后，湿转至NC膜上，用HIS标签抗体蛋白、抗FAdV阳性血清和抗FAdV阴性血清分别反应，HIS标签抗体蛋白和抗FAdV阳性血清在100～130 ku处出现特异性印迹条带，抗FAdV阴性血清对照组无特异性条带(图4)。结果表明，重组蛋白pET-32a-hexon得到表达，且能够被HIS标签抗体和抗FAdV阳性血清特异性识别，具有良好的反应原性。
M.蛋白分子量Marker；1.HIS标签抗体； 2.抗FAdV阳性血清；3.抗FAdV阴性血清。 M. Protein Marker；1.HIS tag antibody； 2.Anti-FAdV positive serum； 3.Anti-FAdV negative serum.
图4 pET-32a-hexon 融合蛋白的Western Blot鉴定
Fig.4 Western Blot identification of fusion proteins pET-32a-hexon
3 讨论与结论
由FAdV-4引起的肉鸡心包积水综合征是一种高度的传染性疾病，主要发生于3～5周龄的肉鸡，病死率高达80%，感染初期，临床症状不明显，很难进行诊断，发病7 d后，死亡率突然上升，7～14 d后死亡率逐渐下降[9-14]，容易与禽类其他疾病比如传染性法氏囊病、新城疫、马立克等病发生混合性感染[15-19]，已经严重危害了养禽业发展，给包括我国在内的世界养禽业造成了严重的经济损失。
六邻体(Hexon)蛋白是FAdV-4的主要抗原蛋白，含有大量的抗原决定簇，包括型特异性、型间特异性及中和表位等，与FAdV-4的致病性密切相关[1-3]。六邻体蛋白是禽腺病毒被研究最广泛的结构蛋白之一，FAdV共有252个壳粒，其中六邻体就有240个，占90% 以上。hexon基因编码942个氨基酸，大小为109 ku，是主要的保护性抗原基因[20]，可以刺激机体产生抗体，进而中和病毒体[21-23]。
本试验采用大肠杆菌原核表达系统对FAdV-4主要结构蛋白六邻体进行表达，首先用PCR方法扩增得到hexon基因的全序列，将其克隆至表达载体pET-32a上，在原核表达系统中在1 mmol/L IPTG，37 ℃条件下诱导3 h，表达量最高，表达出大小约118 ku的六邻体重组蛋白。试验中所用的pET-32a为含氨苄抗性基因的原核高效表达载体，表达产物带有HIS标签，方便其使用商品化镍柱进行纯化。试验中选择的表达菌株为BL21(DE3)，是一个广泛用于表达外源蛋白的宿主菌，尤其适合重组融合蛋白的表达。该细菌缺少细胞膜外的蛋白酶ompT基因和其他多种蛋白酶，降低了重组产物表达后被细胞降解或剪切的概率[15，24-26]。本试验所表达的六邻体重组蛋白，由SDS-PAGE结果分析可得，主要以包涵体形式存在于沉淀中，通过简单的变复性处理之后可得到高表达量、单一的目的蛋白。且通过Western Blot分析可得出，该重组融合蛋白可与HIS标签抗体蛋白和抗FAdV阳性血清发生特异性结合，在100 ku附近出现特异性印迹条带，说明表达的融合蛋白具有良好的反应原性。
本研究成功获得了FAdV-4的主要结构蛋白六邻体(hexon)蛋白，为进一步研究血清4型禽腺病毒提供了参考资料，也为今后制备抗六邻体蛋白单克隆抗体、建立FAdV-4检测方法、以及其引起的心包积水综合征(HPS)的防治奠定了良好的基础。
[1] 罗思思，谢芝勋，邓显文，等. Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及hexon基因的序列分析[J]. 畜牧与兽医，2012，44(1)：52-56.
[2] 邱丽叶. 禽腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2016.
[3] 张鸿意，曲章义，王 鹏，等. 腺病毒六邻体蛋白结构，功能及疫苗研究[J]. 国际免疫学杂，2006，29(2)：126-128.
[4] 金玉霞. 腺病毒六邻体蛋白的免疫学研究进展[J]. 国际免疫学杂志，2002，25(4)：172-174.
[5] 罗思思，谢芝勋，邓显文，等. Ⅰ群禽腺病毒五邻体基因的克隆及原核表达[J]. 广东农业科学，2011，38(7)：154-157.
[6] Kim J N，Byun S H，Min J K，et al. Outbreaks of hydropericardium syndrome and molecular characterization of korean fowl adenoviral isolates[J]. Avian Diseases，2008，52(3)：526.
[7] Domanska-Blicharz K，Tomczyk G，Smietanka K，et al. Molecular characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens with gizzard erosions[J]. Poultry Science，2011，90(5)：983-989.
[8] Niczyporuk J S，Samorek-Salamonowicz E A. Analysis of adenovirus strains isolated from poultry in Poland[J]. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy，2013，57(3)：305-310.
[9] Mase M，Nakamura K，Minami F. Fowl adenoviruses isolated from chickens with inclusion body hepatitis in Japan，2009-2010[J]. Journal of Veterinary Medical Science，2012，74(8)：1087.
[10] Fauquet C M, Mayo M A, Maniloff J, et al. Proceedings of VIIIth report of the international committee，Virus Taxonomy, 1995[C]. Vienna: Springer, c1995.
[11] Fields B N，Knipe D M，Howley R M，et al. Proceedings of the viruses and the irreplication,Thomas Shenk Adenovirde,1996[C]. Plhiadelphia: Lippincott-Rave Publishers, c1996.
[12] 周 斌，刘华雷，曹瑞兵，等. 污染疫苗的禽腺病毒分离和鉴定[J]. 南京农业大学学报，2004，27(3)：78-80.
[13] 李昕键，吴 彻，雷小亚，等. 鸡心包积液综合征病原的分离鉴定与进化分析[J]. 动物医学进展，2017，38(2)：27-31.
[14] 李京帅，李银聚，张春杰，等. 禽腺病毒血清4型河南株的分离鉴定及对鸡胚致病性的研究[J]. 中国兽医科学，2018(4)：1-8.
[15] 楚电峰，刘相娥，薄智勇，等.Ⅰ群禽腺病毒的流行病学和防控研究现状[J].中国动物检疫，2017，34(5)：86-89.
[16] 王亚楠，韩 涛，李纯玲，等. 禽腺病毒Ⅰ群的研究现状[J]. 中国动物保健，2017，19(1)：61-64.
[17] Zhao J，Zhong Q，Zhao Y，et al. Pathogenicity and complete genome characterization of fowl adenoviruses isolated from chickens associated with inclusion body hepatitisand hydropericardium syndromein China[J]. PLoS One，2015，10(7)：e0133073.
[18] Schachner A，Marek A，Jaskulska B，et al. Recombinant FAdV-4 fiber-2 protein protects chickens against hepatitis-hydropericardium syndrome(HHS)[J]. Vaccine，2014，32(9)：1086.
[19] Wang X L，Tang Q X，Chu Z L，et al. Immune protection efficacy of FAdV-4 surface proteins fiber-1，fiber-2，hexon and penton base[J]. Virus Research，2018，245：1-6.
[20] Pei Y L，Corredor J C，Griffin B D，et al. Fowl adenovirus 4 (FAdV-4)-Based infectious clone for vaccine vector development and viral gene function studies[J]. Viruses，2018，10(2)：97.
[21] Pei Y，Corredor J C，Griffin B D，et al. Fowl adenovirus 4(FAdV-4)-Based infectious clone for vaccine vector development and viral gene function studies[J]. Viruses，2018，10(3)：97.
[22] Ye J，Liang G，Zhang J，et al. Outbreaks of serotype 4 fowl adenovirus with novel genotype，China[J]. Emerging Microbes & Infections，2016，5(5)：e50.
[23] Nakamura K，Mase M，Yamaguchi S，et al. Pathologic study of specific-pathogen-free chicks and hens inoculated with adenovirus isolated from hydropericardium syndrome[J]. Avian Diseases，1999，43(3)：414.
[24] 赵冬敏，黄欣梅，刘宇卓，等. 鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS1的原核表达及纯化[J]. 华北农学报，2012，27(6)：11-14.
[25] 吴 萌，王安平，吴海涛. 番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及鉴定[J]. 安徽农业科学，2017，45(35)：124-127.
[26] 文艳玲. 禽腺病毒Ⅰ型hexon蛋白部分基因的原核表达及纯化[J]. 中国畜牧兽医文摘，2014，30(1)：35-36.