小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)主要感染小反刍动物，山羊和绵羊易感，也称羊瘟。野生的小反刍兽也具有易感性。其潜伏期是2～7 d。 动物感染后的主要症状是发热、流涕、腹泻、白细胞减少、呼吸困难、鼻及口腔黏膜溃烂，进而化脓并伴有恶臭气味，怀孕动物会出现流产现象[1-3]。其感染率、死亡率高，被世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health，OIE)定为必须上报A类疫病。该病造成了巨大的经济损失，尤其对发展中国家的养羊业[4]。引起PPR的病原为小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)。其属副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，为单股负链RNA病毒，病毒粒子呈多形性。基因组全长15 948 bp，共有N-P(C、V)-M-F-H-L 6个基因，可编码8种蛋白，6种结构蛋白及非结构蛋白C、V。病毒复制时利用宿主内膜形成囊膜蛋白H、F，并由基质蛋白M将H、F与核蛋白相连。病毒入侵宿主细胞时，H与宿主表面受体结合后F改变构型，发生膜融合，核酸注入细胞质中。装配完全的病毒颗粒通过出芽生殖释放出来。另外，F和H蛋白，可诱导宿主的免疫保护，形成针对H蛋白的中和抗体，参与体液免疫[5-6]。高度的免疫压力使 F蛋白易变异、保守性差[7]。
本研究结合同源模建及多种预测蛋白抗原表位的算法，预测PPRV H 蛋白3D结构及表面特性，分析了PPRV H蛋白结构和功能的关系，旨在为研究和开发PPRV H基因工程疫苗提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 质粒、菌种和毒株 试验所用E.coli 为JM109和Rosetta。所用原核表达载体为pET32a。 所用毒株为PPRV Nigeria75/1 株，由甘肃省动物细胞工程中心保存。
1.1.2 主要试剂、工具酶及引物 试验所用T4 DNA 连接酶、Ex Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶为BamH Ⅰ、Hind Ⅲ，购自大连宝生物公司。RNA提取试剂盒购自北京博凌科为生物科技有限公司。质粒提取试剂盒购自兰州美博生物有限公司。一抗为鼠抗His， 二抗为山羊抗鼠，均购自Sigma公司。His 标签镍离子蛋白纯化柱购自GE 公司。参考PPRV Nigeria75/1毒株H基因序列设计一对PCR引物。上游引物F1：5′-TCCGCACAAAGGGAAAG-3′；下游引物F2：5′-TCAGACTGGATTACATGTTACC-3′。
1.2 试验方法
1.2.1 目的基因扩增 提取病毒基因总RNA，反转录，PCR 扩增。反应体系：Ex Taq DNA 聚合酶0.25 μL，dNTP Mixture 4 μL，10 ×Ex Taq Buffer 5 μL，上、下游引物各 1 μL，反转录产物 cDNA 500 ng，补加 ddH2O 至 50 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min， 35个循环；72 ℃延伸 10 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定所得产物后回收目的片段。
1.2.2 克隆目的基因、测序 回收后的H基因与 pMD18-T 载体连接，转化感受态 JM109细胞，涂布Amp 抗性的平板上(所用抗生素浓度为 1‰)，37 ℃培养12 h；挑取单克隆菌落，1∶100比例接种Amp 抗性的 LB 液体培养基中(所用抗生素浓度为 1‰)，37 ℃摇菌12 h，提取重组质粒，BamHⅠ、 Hind Ⅲ双酶切鉴定，命名阳性质粒pMD18-T-H，测序。
1.2.3 构建重组表达质粒 原核表达载体 pET-32a、阳性重组质粒 pMD18-T-H 分别用BamHⅠ和 Hind Ⅲ双酶切，回收片断，16 ℃过夜连接，总体系(10 μL)：10×缓冲液 1 μL，T4 DNA 连接酶0.5 μL，达到H2O 2.5 μL目的片段5 μL，载体1 μL,H2O 2.5 μL；转化 JM109 ，双酶切鉴定，阳性重组质粒 pET-32a-H。
1.2.4 诱导表达目的蛋白、可溶性分析 转化重组质粒pET-32a-H ，所用大肠杆菌为Rosetta，取转化菌接种至 LB 液体培养基中，37 ℃，220 r/min 过夜；1∶100 比例接种至3 mL新鲜 LB 液体培养基中，37 ℃，220 r/min 振荡培养 1.5 h 至 A 600约为0.6时，取1 mL菌液作为对照，加入 IPTG 至终浓度为1 mmol/L，于 37 ℃诱导培养 6 h，取1 mL 菌液，离心收集菌体进行Lysis Buffer冰上裂解30 min，12 000 r/min离心 10 min，分离上清及沉淀。分别加入 2× SDS 上样缓冲液沸水浴10 min，进行 10% SDS-PAGE 分析。对照组为重组菌诱导前的诱导表达产物及诱导前后pEG32a空质粒。
1.2.5 鉴定表达产物 诱导表达的重组 H 蛋白进行 Western Blot 鉴定。一抗为鼠抗His 标签(1∶3 000 稀释)，二抗为山羊抗小鼠 IgG(1∶10 000 稀释)。
1.2.6 纯化目的蛋白 将诱导培养的 2 L 重组菌以8 000 r/min 离心 30 min，加入Lysis Buffer重悬菌体，超声裂解至澄清后，收集上清，将其加入Ni柱中4 ℃孵育2 h。分别用含50，300，500 mmol/L咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液 ，加入 2 × SDS 上样缓冲液沸水浴 10 min 后，进行Western Blot 分析。
1.3 搜索PDB数据库及PPRV Nigeria75/1 H蛋白3D模型的模拟
利用NCBI数据库Blast功能分析PPRV Nigeria75/1 H蛋白。并于ExPAEy 网站SWIAA-MODLE模块寻找同源蛋白，在线建立蛋白3D模型。于NCBI数据库Structure功能查找蛋白表面模型。
1.4 PPRV Nigeria75/1 H蛋白二级结构预测
利用DNAStar软件提供的Protean模块，采用chou-Fasman算法和Garnier-Robson算法综合分析。
1.5 PPRV Nigeria75/1 H蛋白亲水性预测
通过DNAStar软件Protean模块，采用Kyte-Poolittle预测。
1.6 PPRV Nigeria75/1 H蛋白可塑性预测[8]
通过DNAStar软件Protean模块，采用Karplus-Schultz预测。
1.7 PPRV Nigeria75/1H蛋白表面可及性预测
通过DNAStar软件Protean模块进行Emini预测。
1.8 PPRV Nigeria75/1 H蛋白抗原性指数预测
通过DNAStar软件Protean模块进行Jameson-Wolf预测。
2 结果与分析
2.1 PPRV Nigeria75/1 H 基因PCR产物鉴定
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电压150 V经15 min，得到图1所示结果，目的条带大小1 830 bp，与预期相符。
M.DNA Marker DL2000；1.Nigeria75/1 株病毒H基因扩增产物。 M.DNA Marker DL2000；1.H gene product from Nigeria75/1 PPRV.
图1 Nigeria75/1 株病毒H基因PCR电泳
Fig.1 The electrophoresis of H gene from Nigeria75/1 PPRV
2.2 PPRV Nigeria75/1 H 基因克隆质粒的鉴定及测序
质粒 pMD18-T-H经BamHⅠ、Hind Ⅲ双酶切，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，得到图2所示结果，载体2 692 bp、目的基因1 830 bp ，大小符合预期；PCR所得H基因测序结果与 GenBank 上参考序列相似度为100%。
M.DNA Marker DL2000；1.质粒pMD18-T-H双酶切产物 (BamH Ⅰand Hind Ⅲ)。 M.DNA Marker DL2000；1.Products of plasmid pMD18-T-H digested by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ.
图2 质粒 pMD18-T-H BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切鉴定
Fig.2 The electrophoresis of plasmid pMD18-T-H digested by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ
2.3 重组表达质粒的鉴定
采用BamHⅠ、Hind Ⅲ对重组质粒pET-32a-H 双酶切，通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，可得图3所示结果1 830 bp 的目的基因片段和5 900 bp 的载体片段，表明质粒 pET-32a-H 构建正确。
M.DNA Maker DL10000；1.质粒 pET-32a-H的双酶切产物。 M.DNA Marker DL10000；1.The electrophoresis of plasmid pET-32a-H.
图3 重组表达质粒 pET-32a-H 的BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切鉴定
Fig.3 The electrophoresis of plasmid pET-32a-H digested by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ
2.4 目的蛋白表达的鉴定
2.4.1 SDS-PAGE 分析 诱导表达重组菌，SDS-PAGE鉴定可得图4结果：蛋白相对分子质量约67 ku，对照均无目的蛋白带。H蛋白以包涵体形式表达。
2.4.2 Western Blot 分析 通过抗 His 标签抗体的识别，在67 ku处有目的蛋白条带，结果与预测一致，且在上清中发现有少量可溶性表达(图5)。表明 H 蛋白获得正确表达，且具有良好的反应原性。
M.蛋白质 Marker；1.未诱导的空载体宿主菌；2.空载体宿主菌诱导 6 h；3.IPTG 诱导前重组表达菌；4.pET32a-H IPTG 诱导6 h后的重组表达菌。
M.Standard protein Marker；1.No induced vector host bacteria；2.Vector induced 6 h；3.pET32a-H host bacteria before IPTG induction； 4.pET32a-H host bacteria induced 6 h by IPTG.
图4 重组表达H蛋白的 SDS-PAGE分析
Fig.4 The electrophoresis of recombinant H protein analyzed by SDS-PAGE
M.蛋白质Marker；1.重组表达菌诱导6 h：2.重组表达菌诱导6 h上清；3.重组表达菌未诱导。
M.Standard protein Marker；1.pET32a-H host bacteria induced 6 h by IPTG； 2.Supernatant of pET32a-H host bacteria induced 6 h by IPTG；3.No induced pET32a-H host bacteria.
图5 重组表达H蛋白的 Western Blot 分析
Fig.5 Western Blot of expressed recombinant H protein
2.5 纯化产物的鉴定
经镍柱纯化后，Western Blot 分析，得到图6结果：
在约67 ku处有单一蛋白条带，表明纯化效果良好。
M.蛋白质 Marker；1.纯化的重组 PPRV H 蛋白。 M.Standard protein Marker；1.Purified recombinant H protein of PPRV.
图6 纯化的重组表达H蛋白的 Western Blot 分析
Fig.6 Western Blot profiles of purified PPRV H protein
2.6 PPRV Nigeria75/1 H 蛋白3D模型和蛋白表面
通过ExPAEy 网站SWIAA-MODLE功能在线建立同源蛋白3D模型(图7-A)。所得模型序列一致性为39.26%，H蛋白的三级结构主要由无规则卷曲、β折叠片及α螺旋组成。 β-折叠桶由β折叠片构成，其外部有大量亲水性侧链集团，丰富的非极性氨基酸残基侧链聚集其内部，疏水侧链构成一个封闭的疏水核心区域，使H 蛋白高级结构更加稳定。β-转角和无规卷曲组成松散的结构，更好接触周围极性环境，这些都使其更有可能成为抗原表位。并以同源蛋白为模型于NCBI数据库Structure查询相关蛋白表面模型(图7-B)。
图7 PPRV Nigeria75/1 H蛋白3D模型(A)和表面模型(B)
Fig.7 The 3D model(A) and surface representation(B) of H protein from PPRV Nigeria 75/1
2.7 PPRV Nigeria75/1 H蛋白理化性质
经DNAStar软件Protean模块采用Chou-Fasman和Garnier-Robson算法综合分析可知，PPRV Nigeria75/1 H蛋白等电点为4.95，α螺旋占29.6%，β折叠片占47.9%，转角占12.5%，无规则卷曲占10.3%。
2.8 PPRV Nigeria75/1 H蛋白亲水性
如图8所示，PPRV Nigeria75/1 H蛋白亲水性区域分散分布。亲水性较高区域：1-12，13-27，29-34，69-80，81-92，123-150，151-156，168-178，193-197，210-216，232-247，278-287，311-317，356-366，370-379，386-395，399-408，440-450，487-496，501-511，520-527，530-535，543-553，556-566，571-580，589-598。
2.9 PPRV Nigeria75/1 H蛋白可塑性
PPRV Nigeria75/1 H可塑性较高区域(图9)：5-8，14-16，18-21，26-31，32-35，66-78，80-85，86-95，107-114，119-124，126-131，142-148，168-177，183-188，190-196，224-228，236-248，281-286，301-307，308-319，328-335，340-348，353-356，359-364，368-381，387-393，395-408，421-424，445-450，457-463，473-476，484-494，500-513，518-522，532-536，544-551，560-565，588-602这些区段的柔韧性较高，发生扭曲、折叠的可能性较大。能形成丰富的二级结构。
图8 Nigeria75/1 H蛋白亲水性分析
Fig.8 Analysis of hydrophilicity of Nigeria75/1 H
图9 Nigeria75/1 H蛋白可塑性分析
Fig.9 Analysis of flexible regions of Nigeria75/1 H
2.10 PPRV Nigeria75/1 H蛋白表面可及性分析
应用DNAStar软件，采用Emini方法分析H蛋白表面可及性结果如图10所示。其表面可及性较高的区段为：2-8，11-21，26-32，73-75，83-90，125-135，142-147，170-177，192-195，211-214，235-245，281-285，303-305，312-318，341-346，360-363，370-379，388-391，443-445，446-449，457-461，474-476，486-489，503-505，519-523，530-535，544-552，588-591，592-595。
图10 Nigeria75/1 H蛋白表面可及性分析
Fig.10 Analysis of surface accessibility of Nigeria75/1 H
2.11 PPRV Nigeria75/1 H蛋白抗原表位预测
DNAStar软件中Jameson-Wolf方案预测PPRV Nigeria75/1 H蛋白的抗原表位(图11)。可预测PPRV Nigeria75/1 H蛋白抗原表位可能位于2-9，12-33，69-93，99-106，107-114，118-151，157-164，169-179，183-187，208-217，223-231，235-248，261-266，279-287，292-296，301-305，307-320，328-332，340-351，352-365，370-393，395-399，400-410，419-426，443-450，457-461，471-479，486-495，500-514，518-524，530-537，543-551，557-567，589-601。
图11 Nigeria75/1 H蛋白抗原指数分析
Fig.11 Analysis of the antigenic index of Nigeria75/1 H
2.12 PPRV Nigeria75/1 H蛋白B细胞表位综合分析
综合PPRV Nigeria75/1 H蛋白亲水性、可塑性、表面可及性、抗原表位预测，以及二级结构分析可知，在5-8，14-16，73-75，83-90，125-131，142-147，170-177，236-245，281-285，312-317，360-363，370-379，388-391，445-449，487-489，503-505，520-522，532-535，544-551，592-595这些区段中亲水性、可塑性、表面可及性、抗原表位可能性均较高。且在这些区段均位于α折叠、β螺旋等二级结构中。这使得所预测区段有更大几率成为抗原表位。
3 讨论
虽然用灭活苗免疫动物已可有效防治PPR，但是出于安全考虑，多年来人们致力于安全高效的小反刍兽疫亚单位疫苗[9]。PPRV H 蛋白诱发宿主体液免疫产生中和抗体，体外表达H蛋白及其抗原表位预测是为建立 PPRV 血清学检测方法和制备亚单位疫苗及建立提供基础[10]。
基于原核表达系统表达量高、简便、方便纯化等特点[11-15]。本试验将PPRV H基因克隆于原核表达载体pEG-32a，在大肠杆菌中得到有效表达，主要以包涵体的形式存在，有部分可溶性表达。本研究中表达载体 pET-32a带有His 标签，对目的蛋白免疫原性及功能无影响。
目前，笔者主要通过多维核磁共振技术与X射线晶体学技术研究蛋白高级结构。但现有技术远不能追上探索蛋白质结构功能的步伐。前者不能检测分子量大于30 ku的蛋白质，后者要求得到高标准的蛋白晶体。因此，理论模拟和结构预测十分重要。
随着生物信息学的发展，分析蛋白质的软件多种多样。Hopp等[16]在20世纪80年代首次提出亲水性参数对抗原表位预测的方法。现被广泛认可的方法主要是：二级结构分析、亲水性方案、可塑性方案、可及性方案、抗原性方案[17-18]。B细胞抗原表位的预测需要综合上述5种方案，这是因为蛋白抗原氨基酸残基可分为亲水残基和疏水残基。亲水残基位于蛋白表面，与抗原位点紧密相关[19]。但疏水残基与抗原表位的形成也有联系。蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽骨架有一定的活动性[20]，活动性强的氨基酸残基形成抗原表位的可能性较大。另外，在蛋白质二级结构中α-螺旋、β-折叠片位于蛋白质的疏水区域或蛋白质内部，化学键能较高、结构规则；而β转角和无规卷曲，结构突出，亲水性强，处于蛋白质的表面与抗原表位联系紧密[21]。每种方法具有其优势的同时也存在缺陷。总之，B细胞表位需与B细胞抗原受体(bcr)和抗体结合，故要位于蛋白表面。约由4～6个氨基酸残基或者糖基组成。具有柔韧性，构象可发生变化。
综上所述，本试验成功表达了PPRV H蛋白，得到可溶性表达并纯化。采用同源模建的方法来分析PPRV Nigeria75/1 H的高级结构，提供PPRV Nigeria75/1 H蛋白的直观分子模型，使H蛋白抗原表位预测更准确。结果可为建立针对PPRV的检测方法和疫苗的研制提供依据。
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