核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary)属于子囊菌(Ascomycetes)，核盘菌科(Sclerotiniaceae)，核盘菌属(Sclerotinia)[1]，是一种寄主范围广泛的植物病原真菌，能侵染油菜、向日葵、豆科、葫芦科、茄科蔬菜等400多种植物，引起菌核病[2]。菌核在核盘菌整个生活史中发挥了至关重要的作用，一般情况下，菌核会在被侵染的组织内部产生，多数会在茎的髓部，当然在高湿情况下也可能在发病组织表面产生[3]。核盘菌对寄主的破坏性较大，在其致病过程中草酸和细胞壁降解酶发挥着重要作用[4-6]，而且核盘菌能够产生活性氧并利用寄主过敏性坏死反应来克服寄主防御、促进自身侵染[7-9]。随着核盘菌全基因组序列的公布，核盘菌致病机制的研究开启了新篇章，除了传统的细胞壁降解酶、草酸等致病因子，人们也开始关注一些分泌性效应蛋白在核盘菌与植物互作过程中的作用。例如Guyon等[10]通过分泌组分析找到了78个潜在的效应蛋白候选对象，并对其中的16个分泌蛋白在不同植物中表达模式进行了分析；Lyu等[11]证明了一小分子效应蛋白SsSSVP1能够通过影响植物能量代谢，从而有利于自身侵染；Zhu等[12]研究了一分泌效应蛋白SSITL能于侵染早期阶段，在抑制茉莉酸介导的抗病过程中发挥作用。前期研究明确了分支酸变位酶同源效应蛋白能够提高核盘菌致病性。为了进一步探究其作用机制，对启动子进行了克隆分析，旨在为进一步研究其表达调控奠定基础。
1 材料和方法
1.1 供试材料
核盘菌(Sclerotinia. sclerotiorum)来自德克萨斯农工大学 Prof.Dickman，M.B，GFP来自质粒pBluntNAT-GFP1-1；潮霉素抗性基因hph来自质粒 PUC-ATPH，引物：XS1-1：5′-GCAAGGAGGATCCTAATAG AATC-3′，XS1-2：5′-TCCCCCCGGGGTTGGGTGATTG AAG-3′；hph1：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTC-3′，hph2：5′-CTATTCCTTTGCCCTCGG-3′，由上海生工合成，其他试剂为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 生物信息学分析效应蛋白基因的上游序列 通过启动子在线软件Promoter 2.0和Promoter scan等对上游序列进行分析，以寻找基因的顺式元件及启动子。
1.2.2 效应蛋白启动子的PCR扩增 CTAB法提取核盘菌DNA，采用所设计的引物XS1-1和XS1-2经PCR来扩增基因上游的启动子序列。
1.2.3 启动子的功能验证 GFP融合载体的构建：以pBluntNAT-GFP为基础，插入真菌筛选标记潮霉素抗性基因，再将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中，构建得到启动子+GFP融合载体，具体操作步骤如图1所示：
转化核盘菌：通过REMI介导的真菌转化技术转化核盘菌原生质体，潮霉素筛选转化子[13]。
图1 载体构建流程
Fig.1 Construction of the vector
转化子中GFP荧光检测：采用荧光显微镜检测获得的转化子菌丝GFP荧光表达状态，来验证启动子功能。
2 结果与分析
2.1 启动子预测结果
经过对基因上游大约2 000 bp的片段进行启动子在线预测，结果发现，该基因上游区域-495--745 bp具有启动子序列特征，-536 bp处有一个TATAbox结构，-70--78 bp处含有CAAT box，这些是真菌启动子所具备的启动元件，因此，推测其上游区域具有启动子功能，预测结果如表1所示。
表1 启动子预测结果
Tab.1 The result of the promoter prediction
项目 Item结果 The results处理序列Processed Sequence 2000 Base PairsPromoter region predicted on reverse strand in 745 to 495TATA found at 536, Est. TSS = 504启动子预测序列 Start End Score Promoter SequencePromoter predictions for seq 1 888 1 938 0.98 CTCCTTTCTGGTGGCTGTCATATAAGTACGCTCCCAACCTCAATGTTCAA
2.2 启动子的克隆与融合载体的构建
2.2.1 启动子的PCR扩增 采用CTAB法提取核盘菌DNA，利用引物XS1-1和XS1-2进行PCR扩增，获得长度为733 bp的DNA序列(图2)。
1.启动子的DNA片段；M. DNA Marker DL2000。 1.The DNA of promoter；M.DNA Marker DL2000.
图2 PCR产物的电泳检测
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product
经测序表明，本试验得到分枝酸变位酶基因的上游序列，包含预测的启动子元件，序列如图3所示。
2.2.2 GFP融合载体的构建 以pBluntNAT-GFP为基础，插入真菌筛选标记潮霉素抗性基因，再将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中，取代GFP自身所携带的启动子，构建得到启动子(N-Pro)+GFP融合载体。
2.3 转化子的筛选与验证
将上述载体经REMI介导的技术转化核盘菌原生质体，得到了能在含有潮霉素的PDA培养基上生长的转化子。提取转化子DNA，以hph1-hph2为引物经PCR验证，扩增到了预期条带(图4)，表明载体已整合到转化子基因组中。
图3 启动子DNA序列
Fig.3 The DNA sequence of the promoter
1.对照；2-3.转化子；M.DNA Marker DL2000。 1.CK；2-3.Transformations；M.DNA Marker DL2000.
图4 转化子的潮霉素抗性基因检测
Fig.4 Detection of hph gene in transformation by PCR amplification
2.4 启动子+GFP的转化子荧光表达分析
采用荧光显微镜分别对转化子的菌丝和接种到烟草叶片的菌丝进行荧光检测，菌丝中均检测到了GFP荧光信号(图5)，表明GFP能够正常表达。本结果表明，克隆到的启动子序列能够启动荧光蛋白表达，具有启动子功能。
3 结论与讨论
综上所述，本试验扩增到的分枝酸变位酶同源基因的上游733 bp的DNA序列能够启动GFP表达，具有启动子功能。该启动子的克隆为进一步研究该效应蛋白的功能奠定了基础。
A.菌丝内GFP荧光；B.烟草叶片中菌丝的GFP荧光；C.亮视野下的叶片。 A.The GFP fluorescence of the hyphae；B. The GFP fluorescence of the hyphae in the leaf of tobacco； C.The result in bright field of vision.
图5 融合GFP的荧光检测
Fig.5 Fusion GFP with the nature promoter
莽草酸途径 (Shikimate pathway)是微生物和植物的基本代谢途径，其终产物是分支酸 (Cho-rismate)[14]。分支酸是生物中许多化合物的前体，包括芳香族氨基酸 (如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)、水杨酸 (SA)、IAA及其他次生代谢物[15]。
分支酸变位酶 (Chorismate mutase，CM)催化分支酸转化成预苯酸，为苯丙氨酸与酪氨酸的合成提供前体，从而改变分枝酸进一步转化路径，影响体内水杨酸的水平及其植物抗性水平[16]。对于寄生性的病原微生物来讲，其所需要的苯丙氨酸和络氨酸可以从寄主获得，分枝酸变位酶对于自身氨基酸代谢可能并不是必需的。但通过NCBI数据库中Blast发现，该类基因在部分真菌如黑粉菌(Ustilago maydis)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)等的部分病原微生物体内存在，推测可能在植物病原菌与植物的联系中发挥作用。研究也证明，在专性寄生的黑粉菌中分枝酸变位酶基因Cmu1与其致病性密切相关，侵染后水杨酸水平显著下降[16]。生物信息学分析发现，在死体营养的病原物中仅核盘菌具有分枝酸变位酶同源基因，前期研究表明，该基因与致病性相关，但对其如何发挥作用还不清楚。核盘菌与灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)致病机制类似，属于一种死体营养的病原真菌[17]，通常认为，植物对死体营养病原物的抗性过程中水杨酸通路并不发挥主要作用[18]。水杨酸途径可能是核盘菌侵染的操纵目标，一系列结果表明了水杨酸途径也参与了植物与死体营养真菌的互作[19]。通过拟南芥各类激素突变体的抗性分析发现，核盘菌诱导抗性信号主要由茉莉酸和脱落酸诱导，但不依赖水杨酸信号途径[20]。但是核盘菌接种12 h内水杨酸途径被激活，随后在接种24 h后茉莉酸途径被激活，这些结果证明了油菜抗核盘菌与相继激活水杨酸途径和茉莉酸途径有关[21]。
前期研究表明，核盘菌分枝酸变位酶同源基因与致病性密切相关，对于其在致病过程中如何发挥作用值得进一步探究。通过对其启动子进行克隆，来进一步探究该效应蛋白的表达调控以及在与植物互作过程中的作用机制。下一步将通过酵母单杂交分离与该启动子作用的反式因子，进一步研究其表达调控机理，为其作用机制研究提供帮助。
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