重金属污染已日益成为威胁人类健康的环境问题，而镉(Cd)因其移动性大、毒性持久而成为毒性最强的重金属元素之一[1]。长期暴露在镉污染环境中会导致人体健康受损，包括肺气肿、骨损伤(Itai-Itai)、癌症、心血管疾病和不可逆转的慢性肾功能衰竭[2-4]。
大豆因其含有丰富的营养物质，在世界上的消费越来越广泛[5-6]。但有研究报道，大豆较易吸收重金属[7]。最近的分子生物学研究发现，一些基因家族参与调控植物对Cd的吸收和转运[8-9]，其中也包括了bHLH(Basic helix-loop-helix)转录因子家族[10]。
bHLH是普遍存在于真核生物中的转录因子家族，尤其是在哺乳动物中，其结构、功能和进化都得到了很好的分析[11-12]。近年来，有关bHLH在植物中的功能报道越来越多，主要在植物表皮分化、响应环境胁迫以及调控次生代谢调控中起着重要作用[13-15]。
前期对栽培大豆进行了Cd胁迫，并取其根系进行了转录组测序，对其差异基因进行分析发现，GmbHLH041基因在Cd胁迫后呈上调表达，推测该基因与大豆耐Cd性相关。本试验结合NCBI(National Center for Biotechnology Information)和Phytozome基因组数据库，并通过生物信息学软件，对大豆GmbHLH041基因进行进化树分析和同源序列比对，并通过荧光定量PCR分析Cd胁迫下大豆根系中GmbHLH041基因的表达情况，为进一步明确大豆GmbHLH041基因的功能以及作物在Cd胁迫后的应答机制提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 大豆GmbHLH041基因获得及生物信息学分析
前期对Cd胁迫前后大豆根系进行了转录组测序，分析了差异基因的表达情况，结果发现，通过GmbHLH041基因(GenBank登录号为 XM_006600391)在Cd胁迫后表达量急剧上升。从NCBI数据库中获得GmbHLH041的序列，结合生物信息学分析软件 BioXM 2.6对大豆GmbHLH041蛋白理化性质进行分析。
大豆GmbHLH041蛋白进化树分析：首先使用Clustal X2对氨基酸序列进行比对分析，然后用 MEGA 6 软件中的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统进化树，校验参数 Bootstrap 重复1 000 次。
保守序列多重比对：首先使用Clustal X2对氨基酸序列进行比对分析，导出的文件格式通过GeneDoc软件打开。
1.2 大豆幼苗培养和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析
大豆种子用去离子水浸泡6 h，播种于营养土中，在光照培养箱内催芽。4 d后选取生长一致的幼苗移至1/2 Hoagland 营养液中培养，每2 d更换一次营养液。培养15 d后，用50 μmol/L CdSO4进行处理，取0，24 h的根系，液氮速冻于-80 ℃保存，用于目标基因诱导表达分析。
1.3 总 RNA 提取和 cDNA 合成
将50 μmol/L CdSO4 处理 0，24 h的根部组织用TRIzol 试剂进行提取，通过琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的浓度和纯度。 采用TaKaRa反转录试剂盒反转RNA合成cDNA。
1.4 基因表达分析
根据NCBI中GmbHLH041基因序列设计引物，引物序列为F：5′-GAACACTTCTTCCTCCA-3′；R：5′-ACAACTTTCTCCTCTCAC-3′；以大豆tublin基因作为内参基因，tublin-F：5′-ATTCCCTTCCCTCGTCTG-3′；tublin-R：5′-CCTTGGTGCTCATCTTGC-3′，以cDNA为模板，按照 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)反应体系进行定量 PCR 分析，以组成型表达的tublin 为内参，计算出目标基因的相对表达量，每个样品3次生物学重复。
2 结果与分析
2.1 GmbHLH041的克隆与序列分析
以大豆根系cDNA为模板，利用RT-PCR技术扩增出长度为1 629 bp的GmbHLH041的开放阅读框(Opening reading frame，ORF)，编码542个氨基酸的蛋白质，GmbHLH041蛋白相对分子质量为61.17 ku，理论等电点为5.89，在Phytozome数据库比对发现，GmbHLH041基因位于大豆第17条染色体上。
用SOPMA对GmbHLH041蛋白氨基酸序列的二级结构预测结果显示，该氨基酸序列主要以无规则卷曲(39.48%)、α-螺旋(37.27%)和伸展链(16.61%)为主，含少量的β-转角(6.64%)(图1)。利用TMHMM 2.0 Server对GmbHLH041蛋白的跨膜结构域进行预测，发现该蛋白没有跨膜区段。
图1 GmbHLH041蛋白氨基酸序列的二级结构预测
Fig.1 The secondary structure prediction of the GmbHLH041 amino acids sequence
GmbHLH041. 大豆，XP_006600454.1；GsbHLH041.野生大豆，KHN06623.1；CcbHLH041.木豆，XP_020221722.1；VrbHLH041. 绿豆， XP_014500514.1；VabHLH041. 小豆， XP_017421300.1；LabHLH041. 狭叶羽扇豆，XP_019462343.1；MtbHLH. 蒺藜苜蓿， XP_003595200.2；CabHLH041. 鹰嘴豆， XP_004488061.1；AibHLH041. 花生，XP_020974464.1；AdbHLH041.蔓花生， XP_015954671.1；JrbHLH041.胡桃， XP_018845545.1；MdbHLH041.苹果， XP_008344123.1；SibHLH041. 芝麻， XP_011094007.1；AT5G56960.1 Ⅳd;AT1G68240.1Ⅴ1；AT3G59060.2Ⅶa；AT1G02340.1Ⅵb；AT4G30980.1X1；AT1G25330.1 Ⅻ;AT1G27740.1VⅢC；AT2G42280.1Ⅸ；AT3G47640.1Ⅴb；AT1G49770.1Ⅰb；AT1G69010.1 Ⅴa;AT3G21330.1Ⅷb；AT3G22100.1Ⅷa；AT3G19500.1Ⅹ；AT3G61950.1a；AT5G54680.1Ⅳc；AT2G22770.1Ⅳa；AT1G10610.1Ⅲc；AT4G21330.1Ⅲa；AT4G09820.1Ⅲf；AT5G65640.1Ⅲb；AT2G31210.1Ⅱ；AT1G32640.1Ⅲe；AT4G16430.1Ⅲd.拟南芥bHLH 12个亚家族中的24个bHLH蛋白。
GmbHLH041.(Glycine max，XP_006600454.1)；GsbHLH041.(Glycine soja，KHN06623.1)；CcbHLH041.(Cajanus cajan，XP_020221722.1)；VrbHLH041.(Vigna radiata var. radiate， XP_014500514.1)；VabHLH041.(Vigna angularis， XP_017421300.1)；LabHLH041.(Lupinus angustifolius ，XP_019462343.1)；MtbHLH.(Medicago truncatula， XP_003595200.2)；CabHLH041.(Cicer arietinum， XP_004488061.1)；AibHLH041.(Arachis ipaensis，XP_020974464.1)；AdbHLH041.(Arachis duranensis， XP_015954671.1)；JrbHLH041.(Juglans regia， XP_018845545.1)；MdbHLH041.(Malus domestica， XP_008344123.1)；SibHLH041.(Sesamum indicum， XP_011094007.1)；AT5G56960.1 Ⅳd;AT1G68240.1Ⅴ1；AT3G59060.2Ⅶa；AT1G02340.1Ⅵb；AT4G30980.1Ⅹ1；AT1G25330.1 Ⅻ；AT1G27740.1ⅧC；AT2G42280.1Ⅸ；AT3G47640.1Vb；AT1G49770.1Ⅰb；AT1G69010.1 Ⅴa;AT3G21330.1Ⅷb；AT3G22100.1Ⅷa；AT3G19500.1Ⅹ；AT3G61950.1a；AT5G54680.1Ⅳc；AT2G22770.1Ⅳa；AT1G10610.1Ⅲc；AT4G21330.1Ⅲa；AT4G09820.1Ⅲf；AT5G65640.1Ⅲb；AT2G31210.1Ⅱ；AT1G32640.1Ⅲe；AT4G16430.1Ⅲd.24 Bhlh proteins from 12 bHLH subgroups of Arabidopsis thaliala.
图2 大豆GmbHLH041蛋白和其他物种bHLH蛋白的系统进化树分析
Fig.2 Phylogenetic tree analysis of soybean GmbHLH041 protein and other species bHLH proteins
2.2 大豆GmbHLH041基因编码蛋白系统进化树及保守结构序列分析
GmbHLH041蛋白在NCBI中进行比对，挑选亲缘关系较近的12个其他物种的bHLH，并根据拟南芥中bHLH转录因子亚家族的划分[16]，在每个亚家族中选取至少 1个bHLH 氨基酸序列作为该亚家族的代表，从12个亚家族中共选取了24个 bHLH 蛋白质的氨基酸序列，进行进化树分析，结果显示，GmbHLH041与野生大豆(Glycine soja)和狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)的bHLH041蛋白亲缘关系较近，属于拟南芥bHLH家族第4亚族Ⅳd中(图2)。
多重比对结果发现：GmbHLH041含有一个由60～70个氨基酸组成的保守的bHLH结构域，该结构域包括2个不同功能的保守区域：一个是位于N端参与DNA结合的由15个左右碱性氨基酸组成的区域(The basic region)，另一个是位于C端的HLH区域(The helix-loop-helix region)，主要参与形成二聚体，由2个疏水氨基酸形成的α-螺旋和1个可变环连接而成(图3)。
图3 大豆GmbHLH041蛋白保守序列多重比对
Fig.3 Comparison of amino acid sequences of the bHLH domains of GmbHLH041
2.3 GmbHLH041基因qRT-PCR分析
分析了大豆根系在50 μmol/L CdSO4胁迫24 h后GmbHLH041基因的表达情况，从图4可以看出，根系中GmbHLH041基因在Cd胁迫后表达量极显著上升。
图中不同字母代表差异显著性(P<0.01)。
Different letters in the figure represent significant difference(P<0.01).
图4 50 μmol/L CdSO4胁迫24 h GmbHLH041基因在大豆根系中的表达情况
Fig.4 The expression of GmbHLH041 in soybean roots treated with 50 μmol/L CdSO4 for 24 h
3 讨论
镉是植物非必需营养元素，具有很强的生物毒性和较强的化学活性，在植物体内大量积累，会通过食物链危及人类的健康[2-3，17]。植物在进化过程中会形成一系列机制以应对环境胁迫[2]。
bHLH基因家族广泛参与植物的生长发育[18-19]、应对环境胁迫以及信号通路的调控[20-21]。目前，关于bHLH的研究主要集中在模式植物拟南芥中，近年来，陆续有研究报道，bHLH转录因子参与调控植物对金属离子的吸收。Van等[22]报道，Cd胁迫后，拟南芥以及Zn/Cd超富集植物天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)中bHLH100转录因子的表达量上升，在拟南芥中过表达bHLH100能增加转基因植株对Zn和Ni的耐受性。最新的研究发现，3个拟南芥bHLH转录因子(FIT、AtbHLH38和AtbHLH39)参与了植物对Cd胁迫的响应[10]。
前期对Cd胁迫不同时间的大豆根系进行了转录组测序，对测序结果进行差异基因的筛选，发现GmbHLH041基因在Cd胁迫后表达量极显著上升。通过PCR从大豆根系中克隆到该基因，结合生物信息学预测蛋白结构，分析结果显示，该基因含有一个长度为1 629 bp的开放阅读框(Opening reading frame，ORF)，编码542个氨基酸的蛋白质，GmbHLH041蛋白相对分子质量为61.17 ku，理论等电点为5.89，位于大豆第17条染色体上。与拟南芥的系统进化树分析显示，GmbHLH041属于第4亚族Ⅳd中，对4个bHLH同源基因氨基酸序列分析结果显示，GmbHLH041含有一个典型的bHLH结构域。荧光定量PCR结果表明，GmbHLH041基因在Cd胁迫后的大豆根系中上调表达，表明该基因可能与镉胁迫调控有关。已经进一步构建了表达载体，以期获得转基因植株，进一步研究该基因的生物学功能。
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