hrp基因(hrp，Hypersensitive response and pathogenity gene)广泛存在于革兰氏阴性植物病原细菌中，能够表达一种热稳定性Harpins蛋白，该蛋白不仅能够促进植物的生长发育[1-2]，也会引起非寄主植物的过敏反应(HR，Hypersensitive response)，Harpins蛋白能够广泛诱导植物对植物病虫害的防卫反应，增强植物的免疫反应[3-7]。研究表明，植物病原菌主要通过Ⅲ型分泌通路将Harpin蛋白分泌到植物细菌细胞外，能够激发非寄主植物的HR或诱导植物对病原菌产生抗病性 [8-11]。因而，开发新型Harpin蛋白和研究Harpin诱导防卫机制已成为新研究热点。自1986 年Lindgren等[12]首次报道hrp基因以来，人们对hrp基因进行了广泛的研究。HarpinEa是一种从梨火疫欧文氏杆菌(Erwinia amylovora)中分离到的Harpin蛋白，它能够诱发烟草HR反应[12-13]。1995年Cui等[14-15]借助分子生物学手段首次从胡萝卜软腐欧文氏菌(E. carotovora subsp. carotovora)Ecc71中分离到hrpN基因并克隆该基因。国内科研人员越来越多地研究Harpin蛋白和hrp基因，其中对来源于胡萝卜软腐欧文氏菌的Harpin蛋白的研究有了很大的进展，对其表达hrp基因克隆的研究也有了很大的突破，科研人员分别从E. carotovora subsp. carotovora CSSY002、 carotovora CSDS001以及betavasculorum CSL101等菌株中克隆到不同基因序列的hrp基因，这些hrp基因均能表达氨基酸序列不同程度差异的Harpin蛋白，但这几种Harpin蛋白均能诱导烟草过敏反应。携带hrp基因的不同植物病原菌携带的hrp基因具有一定的保守性，但也存在着很大的差异性，而其表达的Harpin蛋白对诱导不同的植物产生抗性也不同。本研究主要报道高致病性病原菌胡萝卜软腐欧文氏 (E. carotovora pv. carotovora) Ecc36菌株的胞外酶活性，对其致病性进行了鉴定，克隆了Ecc36菌株中的hrpNEccPR基因，并进行了筛选和测序，通过构建的pET30a-EccPR质粒在大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)中高效IPTG诱导表达HrpNEccPR蛋白，鉴定产物HrpNEccPR蛋白的生物学活性。
1 材料和方法
1.1 试验材料
Ecc36菌株由河北省科学院生物研究所生物工程实验室收藏；大肠杆菌工程菌株BL21(DE3) (大连宝生物工程有限公司)；pET28a(+)质粒(大连宝生物工程有限公司)；LB培养基利用文献[9-10]中的方法进行配制；抗性培养基为LB培养基中加入50 μg/mL卡那霉素(Km)。提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；DNA 纯化试剂盒(Qiagen公司)；DNA标记系统(Promega公司)。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株Ecc36 胞外酶的检测 参考文献[15-16]配制菌株Ecc36胞外酶的琼脂固体平板培养基，利用文献[17]中的方法检测Ecc36菌株分泌的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，Peh)、蛋白酶(Protease，Prt)、纤维素酶(Cellulase，Cel)及果胶酶(Pectate lyase，Pel)活性。通过平板上菌落周围的透明圈大小分析酶活性水平。
1.2.2 菌株Ecc36 对植物的致病性 挑取Ecc36菌株单菌落，培养24 h后，用无菌水将菌体稀释成5×109 cfu/mL的菌悬液，利用悬浮液接种于大白菜，每个孔接种0.05 mL，28 ℃保湿培养，48 h后根据大白菜软腐程度判断菌株致病情况。
1.2.3 菌株Ecc36 过敏反应测试 将菌株Ecc36单菌落接种到LB 液体培养基，将菌株28 ℃培养24 h后，用无菌10 mmol/L氯化镁溶液稀释成2×108 cfu/mL菌悬液，采用0.3 mL菌悬液注射到烟草叶片的方法来检测Ecc36过敏反应活性，用无菌10 mmol/L氯化镁溶液作为对照。接种24 h后，观察烟草叶片是否出现坏死斑现象。
1.2.4 hrpNEccPR 基因的鉴定 利用Southern杂交方法鉴定hrpNEccPR基因，用EcoRⅠ消化Ecc36菌株染色体DNA，以地高辛标记的Ecc36菌株hrpN DNA为探针进行Southern杂交。杂交条件见参考文献[18]。
1.2.5 携带hrpNEccPR 工程菌的构建 参考hrpNEcc71基因，合成文献[19]中报道的hrpNEcc71上下游引物，进行PCR 扩增，反应条件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环25次。将纯化的PCR产物，经内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ进行酶切构建到质粒载体pET30(+)上，形成了pET30a-EccPR表达质粒。基因测序由上海生工完成，根据测序结果，hrpNEccPR基因进行分析。基因扩增和克隆方法见文献[20-22]。将质粒pET30a-EccPR转化到大肠杆菌BL21(DE3)，构建高效表达的大肠杆菌工程菌。
1.2.6 HrpNEccPR的诱导表达及检测 将工程菌BL21(DE3)在卡那霉素抗性的LB液体培养基中37 ℃培养，当培养菌液的OD600=0.6～0.8时，加入终浓度为0.8 mmol/L的 IPTG进行诱导培养，8 h后，离心收集菌体，4倍体积的缓冲溶液重悬，煮沸10 min，收集上清液。
HrpNEccPR蛋白的12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 检测方法参照文献[23]。
1.2.7 HrpNEccPR的活性检测 利用HrpNEccPR蛋白分别配制浓度为100，50，25 μg/mL蛋白水溶液，分别接种到烟草叶片，24 h后检查HR枯斑，水为对照。
2 结果与分析
2.1 菌株Ecc36 的致病性及其过敏反应
菌株Ecc36 是一种软腐病致病菌株，其致病性由植物细胞壁降解酶类(Plant cellwall-degrading enzymes，PCWDEs) 决定[24-25]，这些酶类分别为果胶酶(Pel)、多聚半乳糖醛酸酶(Peh)、蛋白酶(Prt)和纤维素酶(Cel)。胞外酶检测结果显示，Ecc36菌株能分泌Pel、Peh、Prt、Cel，且这4种酶具有较高活性(图1)。将Ecc36菌株接种于大白菜并温育48 h，大白菜出现明显的软腐病斑块，而对照(CK)不产生软腐病症(图2)，说明Ecc36菌株具有较强致病性，也推断出Ecc36菌株高致病性可能与胞外酶的活性有关系。为了检测Ecc36菌株过敏反应症状，将Ecc36菌株接种于烟草叶片，以MgCl2为阴性对照，试验结果表明，Ecc36菌株培养液及上清液均能引起烟草的过敏反应(图3)，说明Ecc36菌株分泌物中含有Harpin蛋白或者相似的物质。
图1 Ecc36菌株分泌的胞外酶
Fig.1 Extracellular enzymes produced by Ecc36
图2 Ecc36菌株引起大白菜软腐
Fig.2 Soft rot caused by Ecc36 in chinese cabbage tissue
2.2 hrpNEccPR 基因的鉴定及克隆
成地高辛标记的hrpN基因核苷酸序列探针，建立Ecc36基因文库，通过菌落原位杂交技术，对Ecc36基因文库进行筛选。图4显示，从该文库中筛选出3个阳性克隆菌，分别为34号、63号和89号克隆菌斑。通过EcoRⅠ消化的89号菌斑(Ecc36-89)染色体DNA、Ecc71 DNA和大肠杆菌BL21 DNA，进行Southern杂交，试验结果显示，Ecc71具有阳性杂交带片段，Ecc36-89也出现了阳性杂交带片段，而阴性对照大肠杆菌BL21染色体DNA没有出现阳性克隆杂交带(图5)。结果表明，Ecc36基因组中含有hrpN基因。
A.MgCl2溶液；B.Ecc36培养液；C.Ecc36培养液上清液。A. MgCl2 solution；B. Culture solution with Ecc36；C. Supernatant of Ecc36 culture solution.
图3 Ecc36菌株诱导烟草产生过敏反应
Fig.3 HR elicited by Ecc36 in tobacco
图4 原位杂交结果
Fig.4 In situ hybridization
图5 hrpN基因Southern 杂交
Fig.5 Southern Blot analysis of hrpN gene
2.3 hrpNEccPR 基因的核苷酸序列及HrpNEccPR 蛋白的氨基酸序列
将Ecc36-89基因组中克隆的hrpN基因命名为hrpNEccPR基因，hrpNEccPR基因测序结果表明，其编码开放阅读框(ORF)为1 254个核苷酸(图6)，与来自其他hrpNEch、hrpNEcc编码基因相比分别具有87.8%和86.6%的序列同源性。
hrpNEccPR基因编码的蛋白HrpNEccPR由417个氨基酸残基组成，理论分子量45.27 ku，理论等电点5.73，序列中富含甘氨酸(G)。Ecc36 与其他几个菌株来源的hrpN 编码氨基酸序列(HrpNEch、HrpNEcc)同源性较高，通过和其他hrpN基因编码的蛋白序列相比较，同源性达到43%(图7)，而且C末端和N末端的同源性非常高，推测是其功能区域。这也和hrpN基因编码的蛋白功能一致，说明了生物的遗传多样性。
图6 hrpNEccPR基因序列
Fig.6 HrpNEccPR gene sequence
图7 HrpNEccPR蛋白序列
Fig.7 hrpNEccPR protein sequence
2.4 携带hrpNEccPR 基因的工程菌诱导表达
将hrpNEccPR 基因构建在pET30a，命名为pET30a-EccPR，并转入BL21(DE3)中，获得大肠杆菌工程菌BL21(pET30a-EccPR)，经IPTG诱导表达工程菌BL21(pET30a-EccPR)，SDS-PAGE(浓度为12%)蛋白电泳结果显示(图8) ，含有空载体质粒的BL21(DE3)大肠杆菌经IPTG诱导后不产生目的蛋白条带，工程菌BL21(pET30a-EccPR)经IPTG诱导能够产生目的条带，不经IPTG诱导，也不会产生HrpNEccPR蛋白目的条带。这些结果表明，工程菌在IPTG诱导下能够表达HrpNEccPR蛋白。
2.5 HrpNEccPR 蛋白诱导过敏反应
植物过敏反应已经成为检测一种蛋白或者小分子化合物具备Harpin类蛋白条件的一种重要生物测试方法，为检测HrpNEccPR蛋白的生物学活性，将纯化的HrpNEccPR蛋白(图8)接菌于烟草叶片，结果显示，纯化的HrpNEccPR蛋白能诱导烟草叶片产生过敏反应(图9)，这与已报道的其他Harpin类蛋白的生物学活性一致，也说明HrpNEccPR蛋白是Harpin类蛋白的一种。试验结果也显示，HrpNEccPR蛋白诱发的植物过敏反应斑块大小与其浓度有关，随着HrpNEccPR蛋白浓度的增加，过敏反应病斑随之扩大，50 μg/mL的HrpNEccPR蛋白即能显著诱导过敏反应，而对照处理不引起过敏反应。
M.Marker； 1.BL21(DE3)/ pET-28a(+) + IPTG ； 2.BL21(DE3)/ pET30a-EccPR；3.BL21(DE3)/ pET30a-EccPR+IPTG ； 4.提纯的HrpNEccPR蛋白。
M.Marker； 1.BL21(DE3) carrying pET28a(+) + IPTG； 2.BL21(DE3) carrying pET30a-EccPR，no IPTG； 3.BL21(DE3) carryingpET30a-EccPR+IPTG； 4.Purified HrpNEccPR.
图8 HrpNEccPR蛋白在工程菌中的IPTG诱导表达
Fig.8 Expression of HrpNEccPR induced by IPTG in engineering strain
A.水；B.HrpNEccPR 50 μg/mL； C.HrpNEccPR 200 μg/mL；D. HrpNEccPR 100 μg/mL。A.H2O； B.HrpNEccPR 50 μg/mL； C.HrpNEccPR200 μg/mL； D.HrpNEccPR 100 μg/mL.
图9 纯化的HrpNEccPR蛋白诱导过敏反应
Fig.9 HR elicited by purified HrpNEccPR
3 讨论与结论
Harpin蛋白是一类这些年来一直被关注的重要生物效应分子，Cui等[17]通过胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种Ecc71研究发现了由hrp 基因编码的Harpin 蛋白，该蛋白是引发非寄主植物过敏性反应的重要因子，试验也证明，该蛋白能够诱导烟草叶片产生过敏反应，因而，hrp基因的遗传组成、表达调控及产物、功能已成为研究该领域的重点内容。通过对植物细胞壁降解酶类检测和分析，发现胡萝卜软腐欧文氏Ecc36菌株具有很强的胞外酶分泌活性，能够降解植物细胞壁[26]，也是Ecc36的关键致病因子。hrpNEccPR基因测序结果显示，与其他几种来源于胡萝卜软腐欧文氏菌的Harpin蛋白编码基因序列具有很高的同源性，HrpNEccPR蛋白的氨基酸序列分析表明，其氨基酸序列与HrpNEcc蛋白、HrpNEch蛋白序列具有很高的同源性。而通过工程菌高效表达的HrpNEccPR蛋白仍具有Harpin蛋白的活性，能诱导植物产生HR反应，这些结果表明，HrpNEccPR蛋白能够提高植物本身的免疫机能，诱导植物对胁迫环境产生抗性。Harpin蛋白主要来源于革兰氏阴性植物病原细菌，在梨火疫欧文氏杆菌和胡萝卜软腐欧文氏菌中也存在Harpin蛋白表达基因，张珏等[20]报道了HarpinCSDS001诱导植物抗性、促进植物生长发育的作用机制，曹茂林等[27]报道了胡萝卜欧文氏菌CSSY002表达的Harpin蛋白生物学活性，Kariola等[28]报道，胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种细菌产生的Harpin蛋白能够诱导拟南芥的防卫反应。HrpNEccPR蛋白是胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株表达的蛋白激发子，它能诱导植物产生免疫反应，使植物发生过敏坏死反应，笔者正在通过室内和田间试验研究HrpNEccPR蛋白的抗病性、抗虫性、抗逆性、促进生长和发育等特性。希望通过这一系列的基础和应用研究，能将HrpNEccPR蛋白开发成新型、安全、高效的植物诱抗剂，使HrpNEccPR蛋白在未来的农业高新生物技术领域中扮演重要角色。
利用烟草验证了胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株能够引起过敏反应(HR)，克隆了Ecc36菌株的hrpN基因(hrpNEccPR基因)的开放阅读框，通过基因测序和比对，与其他软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性，表明hrpNEccPR基因表达的蛋白具有Harpin蛋白特性。构建hrpNEccPR基因表达载体(pET30a-EccPR)，并获得表达HrpNEccPR蛋白大肠杆菌工程菌，诱导获得的HrpNEccPR蛋白纯化后，具有激发植物免疫反应的生物活性。
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