非生物逆境胁迫如低温、干旱等是限制植物正常生长、发育的重要因素，严重时会对植物造成伤害甚至死亡。但是植物在面对非生物逆境胁迫时并不是完全被动和消极的，它能够快速感知逆境，并通过信号传递积极而主动的适应[1]。植物中存在一个以CBF(C-repeat binding factor/dehydration-responsive element binding factor，CBF/DREB1) 转录因子为主导的低温和脱水响应通路[2]，该类转录因子能调控下游抗逆基因的表达[3-6]，从而提高植物对干旱、低温等非生物逆境胁迫的抵抗。CBF是一个基因家族，1997年Stockinger等[7]首次在低温诱导的拟南芥中分离出CBF1转录因子，1998年Gilmour等[8]又从低温诱导的拟南芥cDNA文库中克隆了CBF1、CBF2、CBF3基因，随后又相继从拟南芥中克隆出CBF4、CBF5、CBF6基因。
目前，已经从多种植物中克隆出转录因子CBF基因[2，9-10]，并对CBF基因在逆境条件下的诱导表达进行了研究[10-13]。但杏扁CBF基因的克隆研究未见报道。杏扁(Prunus armeniaca L.)抗旱耐寒，防风固沙，经济和生态效益显著 [14]，然而生产中杏扁基地建设一般面向丘陵山区，以干旱地带为主，春季花和幼果又常遭遇低温和晚霜危害。因此，克隆和分析杏扁CBF基因，对杏扁抗逆性的研究具有重要的意义。本研究选取生产上较抗寒的杏扁品种围选1号为试材，克隆其 CBF 基因全长，并对其进行生物信息学分析。为今后进一步研究杏扁CBF转录因子的功能并对逆境环境的抵抗机制提供理论基础，为生产中提高杏扁的抗逆性提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料与处理
本试验以河北北方学院园艺系标本园内栽植的杏扁品种围选1号为材料。于2016年4月树体萌芽时，采集1年生的枝条，带回实验室，4 ℃水培处理4 h后采集幼叶。幼叶经液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存，用于PaCBF1基因的克隆。
1.2 试验方法
1.2.1 围选1号总RNA的提取及检测 利用植物总RNA小量提取试剂盒提取总RNA。采用琼脂糖凝胶电泳技术，对提取的RNA进行完整性检测。
1.2.2 cDNA第 1链的制备 利用TIANScriptⅡ cDNA第1链合成试剂盒合成cDNA第1链。
1.2.3 PaCBF1基因编码区全长cDNA的扩增 根据GenBank公布的梅CBF基因序列(登录号：NM_001301005.1)设计特异引物，扩增围选1号CBF基因编码区全长cDNA。引物序列CBF1-F：5′-GCATATAGCTTACTCTAATGGAC-3′；CBF1-R：5′-CCGCTCGAGTTAAATGGAGAAACTCCACAATT-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。在CBF1-R引物的5′端添加了XhoⅠ酶切位点CTCGAG及保护碱基CCG。
PCR反应体系：模板cDNA 1 μL，CBF1-F(10 μmol/L) 1 μL，CBF1-R(10 μmol/L) 1 μL，2×PCR mix 10 μL，ddH2O 7 μL，总体积20 μL。采用降落PCR扩增，循环参数为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸80 s，2个循环；94 ℃变性50 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸80 s，2个循环；94 ℃变性50 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸80 s，2个循环；94 ℃变性50 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸80 s，25个循环；最后72 ℃延伸10 min。第一轮PCR反应结束后，以第1轮反应产物为模板进行第2轮PCR扩增。第2轮PCR扩增时的反应体系与反应程序同第1轮PCR反应。
1.2.4 PaCBF1基因片段的回收、连接、转化及阳性克隆的筛选 PaCBF1基因片段采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收；将回收的PaCBF1基因片段采用pGM-T克隆试剂盒与pGM-T载体连接构成重组DNA，然后将重组DNA转化到DH5α感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素、 IPTG和X-gal的LB固体筛选培养基上，37 ℃过夜培养。挑取白色单菌落于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养8 h，提取质粒，PCR检测后，挑选阳性克隆，送北京华大基因公司测序。
1.2.5 PaCBF1基因的生物信息学分析 对获得的杏扁PaCBF1基因序列利用DNAMAN 8.0软件寻找最长的开放阅读框(Open reading frame，ORF)；在NCBI上用Blast(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对PaCBF1基因序列和蛋白序列进行比对分析；使用ProtParam tool(http：//web.expasy.org/protparam/)在线分析杏扁PaCBF1蛋白的氨基酸组成以及理化性质；使用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)在线预测PaCBF1蛋白的二级结构；使用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)构建 PaCBF1蛋白的三级结构。使用BaCelLo(http：//gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)以及PSORT Ⅱ(https：//psort.hgc.jp/form2.html)在线工具对杏扁PaCBF1蛋白进行亚细胞定位预测；使用SignalP-4.1 Server在线软件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对 杏扁PaCBF1蛋白进行信号肽分析；采用 Kinase Phos(http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)对杏扁PaCBF1蛋白进行磷酸化位点分析。
2 结果与分析
2.1 杏扁PaCBF1基因编码区全长cDNA的克隆
以杏扁品种围选1号cDNA的第1链为模板，CBF1-F和CBF1-R序列为引物，进行RT-PCR 扩增，获得了750 bp左右的cDNA片段(图 1)。将扩增片段回收、连接、转化，提质粒检测，挑取阳性克隆测序。测序结果经过Nucloetide Blast比对，与GenBank公布的梅CBF基因序列(登录号：NM_001301005.1)同源性达到94%，这说明该序列属于CBF基因家族成员。将该序列命名为杏扁PaCBF1，并将该序列提交到GenBank，获得基因登录号：MF491392。
2.2 杏扁PaCBF1基因编码区全长cDNA的序列分析
利用DNAMAN 8.0软件分析，杏扁PaCBF1基因具有一个完整的ORF，片段长度为 723 bp，终止密码子为 TAA，编码 240个氨基酸(图2)。对杏扁PaCBF1基因的氨基酸序列进行Protein Blast比对，结果表明，其含有转录因子家族保守的AP2结构域(图3)。进一步分析发现(图2)，杏扁PaCBF1蛋白含有植物CBF蛋白的保守结构域，分别为：PKKRAGRRVFKETRHP域，该氨基酸序列仅在CBF蛋白中发现，作为碱性氨基酸残基核心定位信号；DSAWR域，该序列也仅在CBF蛋白中发现；LWSF域，该序列主要作为双子叶植物CBF蛋白特征[15]。
M.DL2000 DNA Marker；1～2.RT-PCR扩增产物。M.DL2000 DNA Marker；1-2.Amplified product of RT-PCR.
图1 PaCBF1基因RT-PCR产物电泳
Fig.1 Electrophoresis map of RT-PCR product of PaCBF1 gene
上排为cDNA序列，下排为氨基酸序列；ATG为起始密码子，TAA为终止密码子；双下划线标注的为植物CBF蛋白保守结构域，单下划线标注的为AP2 DNA结构域。The upper lines are cDNA sequences，the lower lines are amino acid sequences；ATG is the start codon，TAA is the stop codon；Amino acids on double underlines represent characteristic sequences of CBF protein of the plant，amino acids on single underline represent AP2 DNA-binding domains.
图2 PaCBF1 cDNA序列与其氨基酸序列
Fig.2 cDNA sequence and amino acid sequence of PaCBF1 gene
图3 保守域预测
Fig.3 Putative conserved domains
2.3 杏扁PaCBF1蛋白理化性质的预测及其氨基酸组成的分析
使用ProtParam tool在线预测杏扁PaCBF1蛋白的相对分子质量为 26.928 ku，理论等电点为6.35，分子式为 C1160H1842N344O363S16，原子总数为3 725，半衰期为30 h。该蛋白的疏水性平均值为-0.555，由于正值越大表示越疏水，负值越大表示越亲水，说明该蛋白为亲水蛋白。PaCBF1蛋白的氨基酸组成见表1，Ser、Arg、Ala的相对含量较高，分别为10.8%，9.6%，9.2%；Gln、Tyr的相对含量最低，均为1.7%。带负电荷的Asp残基数为20，Glu残基数为17；带正电荷的Arg残基数为23，Lys残基数为13。
表1 PaCBF1蛋白的氨基酸组成
Tab.1 Amino acid composition of PaCBF1 protein
氨基酸Aminoacid数目Number百分比/%Percent氨基酸Aminoacid数目Number百分比/%Percent氨基酸Aminoacid数目Number百分比/%PercentAla(A)229．2Gly(G)156．2Pro(P)104．2Arg(R)239．6His(H)31．2Ser(S)2610．8Asn(N)72．9Ile(I)52．1Thr(T)72．9Asp(D)208．3Leu(L)197．9Trp(W)52．1Cys(C)52．1Lys(K)135．4Tyr(Y)41．7Gln(Q)41．7Met(M)114．6Val(V)156．2Glu(E)177．1Phe(F)93．8
2.4 杏扁 PaCBF1蛋白二级结构以及三级结构的预测
使用SOPMA在线预测杏扁PaCBF1蛋白的二级结构，结果显示该蛋白主要由38.75%的无规则卷曲(Random coil)、29.58%的α-螺旋(Alpha helix)、22.92%的延伸链(Extended strand)和8.75%的β-转角(Beta turn)组成(图4)。利用SWISS-MODEL进行杏扁PaCBF1蛋白的三级结构的构建，预测结果显示有α-螺旋、β-折叠和β-转角，及该蛋白的三维空间结构(图5)。
C.无规则卷曲；E.延伸链；T.β-转角；H.α-螺旋。C.Random coil；E.Extended strand；T.Beta turn；H.Alpha helix.
图4 PaCBF1蛋白二级结构
Fig.4 Secondary structure prediction of PaCBF1 protein
图5 PaCBF1蛋白三级结构预测
Fig.5 Tertiary structure prediction of PaCBF1 protein
2.5 杏扁PaCBF1蛋白亚细胞定位预测
使用PSORTⅡ在线工具预测杏扁PaCBF1蛋白的亚细胞定位情况，结果显示：PaCBF1蛋白定位在细胞核中的可能性为60.9%，定位在细胞骨架的可能性为17.4%，定位在细胞质的可能性为13.0%，定位在高尔基体的可能性为4.3%，因此，推断杏扁PaCBF1蛋白定位在细胞核中。同时使用BaCelLo在线分析结果表明，杏扁PaCBF1蛋白也定位在细胞核中(图6)。
2.6 杏扁PaCBF1蛋白信号肽分析
使用SignalP-4.1 Server在线软件对杏扁PaCBF1蛋白进行信号肽分析，结果显示S值、C值、Y值的变化趋势均较平稳，D值中的signal peptide为No，说明该蛋白不存在信号肽序列，没有剪切位点，不是分泌蛋白 (图7)。
2.7 杏扁PaCBF1蛋白磷酸化位点分析
采用Kinase Phos 在线工具对杏扁PaCBF1蛋白进行磷酸化位点分析，结果见图8。 从图8可以看出，杏扁PaCBF1蛋白的每个磷酸化位点所处的位置。该编码蛋白共有1处酪氨酸(Tyrosine，Y)磷酸化位点、1处苏氨酸(Threonine，T)磷酸化位点、11处丝氨酸(Serine，S)磷酸化位点。
图6 PaCBF1蛋白亚细胞定位
Fig.6 Subcellular localization of PaCBF1 protein
图7 PaCBF1蛋白信号肽分析
Fig.7 Signal peptide analysis of PaCBF1 protein
图8 PaCBF1蛋白磷酸化位点分析
Fig.8 Phosphorylation site analysis of PaCBF1 protein
3 讨论
生物信息学就是从核酸和蛋白质序列出发，分析序列中表达的结构功能的生物信息。在基因研究中，利用生物信息学进行前期或后续分析越来越普遍[16]。本研究应用生物信息学对杏扁PaCBF1基因和PaCBF1蛋白序列进行了具体的分析。
目前，低温信号转录因子中被研究最多的就是CBF转录因子[17]。它属于AP2 转录因子家族，含有非常保守的DNA 结构域，不含内含子[18]，能结合到CRT/DRE(CCGAC/TACCGACAT)顺式作用元件上[7]，起反式作用因子功能，调控植物的细胞周期、生长发育以及非生物逆境胁迫相关基因的表达[16]，进而提高植物的抗逆性。本研究在杏扁围选1号中克隆了1个CBF基因，命名为杏扁PaCBF1，GenBank上基因登录号为MF491392。进一步分析发现杏扁PaCBF1蛋白含有一个高度保守的AP2结构域，以及植物CBF蛋白的保守结构域PKKRAGRRVFKETRHP和DSAWR，这与前人研究相吻合[19-20]；该蛋白在AP2结构域处含有1个α-螺旋、3个β-折叠，其中第14位的缬氨酸(V14)和第19位的谷氨酸(E19)是决定CBF/DREB与CRT/DRE特异性结合的关键位点[21]，这2个氨基酸残基在PaCBF1蛋白中保守存在。
信号肽位于分泌蛋白的N-端，由15～60个氨基酸组成，指导分泌蛋白发生跨膜转移与定位[22]。目前Signal是预测蛋白质是否含有信号肽的应用最广泛的预测软件之一[23]。本研究使用SignalP-4.1对杏扁PaCBF1蛋白进行信号肽分析，结果表明，该蛋白不存在信号肽序列，没有剪切位点，不是分泌蛋白，这与张亮等[24]对扁桃CBF1基因的研究结果相一致。同时对杏扁PaCBF1蛋白的亚细胞定位进行预测，结果显示该蛋白定位在细胞核中。
蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，包括蛋白质磷酸化修饰与去磷酸化修饰，是一种可逆的过程[25]。磷酸化修饰具有改变和调控蛋白质-DNA/RNA互作、蛋白质-蛋白质互作、蛋白质稳定性以及酶活性的潜能，进而影响蛋白质功能[26]。在真核生物中，蛋白质磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上[27]。一个磷酸化蛋白质可能含有1个或多个磷酸化氨基酸位点[28]。本研究采用Kinase Phos在线工具分析杏扁PaCBF1蛋白，结果表明，该蛋白有11处丝氨酸磷酸化位点、1处苏氨酸磷酸化位点和1处酪氨酸磷酸化位点。磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一，与信号传导、细胞周期、生长发育等密切相关。由此推测，杏扁PaCBF1蛋白质的可逆磷酸化可能是杏扁在逆境胁迫下的主要信号传递方式。
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