由于工业“三废”和生活垃圾的不得当处置，污水灌溉，以及农药化肥的不合理使用，果园土壤已不同程度受到镉等重金属的污染。镉是毒性很强的重金属，可对果品安全生产及人类健康构成严重威胁[1]。高浓度镉能够诱导植物产生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，对细胞膜、蛋白和核酸等生物大分子具有破坏作用，严重时导致细胞死亡。植物根系中的ROS主要来源于线粒体，反过来线粒体又是ROS作用的靶子，它可提高线粒体膜通透性，引起细胞色素c(Cyt c)释放；Cyt c是线粒体呼吸链上传递电子的载体，线粒体Cyt c的流失可直接引起电子传递受阻或中断，刺激线粒体膜通透性进一步开放，从而产生更多的ROS，继而引发一系列下游反应，最终导致细胞受损坏死[2]。镉胁迫使平邑甜茶根系线粒体MTP增大，膜电位(Δψm)和 Cyt c含量下降，H2O2含量升高，最终导致细胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)的发生[3]。

近几年，越来越多的研究表明新型内源性气体信号分子硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S) 具有复杂的生物学活性，参与多种生理和病理过程，其在植物中的作用逐渐被发现。在调节植物生长发育方面，H2S可促进种子萌发[4]，调控保卫细胞[5]，增强叶片光合作用[6]，延迟衰老等[7]。在植物抗逆方面，H2S可以通过减小叶片气孔孔径，激活抗氧化系统，调控离子通道活性及基因表达等参与植物对盐碱[8]、重金属[9]、温度[10]等逆境胁迫的响应。并且，H2S与ROS、NO、Ca2+和植物激素等信号路径存在相互作用，共同调控植物生长发育和逆境胁迫响应过程[11-12]。Ca2+作为植物细胞的第二信使，胞内Ca2+水平改变，转导多种生理过程。Ca2+/CaM参与H2S介导的烟草悬浮细胞耐热性的提高[13]，在谷子响应Cr6+胁迫的过程中，Ca2+调控H2S的产生，外源H2S促进Ca2+响应基因的表达，Ca2+作为初始信号与H2S相互作用[12]。

关于H2S对植物Cd胁迫的缓解作用已有一些报道，但多以草本植物或悬浮细胞为研究对象。果树生长在受镉污染的土壤中，根系首当其害，但国内外对根系的研究远不如对地上部的研究广泛和深入。平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)是优良的苹果砧木资源，抗性较强，在生产上具有重要的应用价值[14]。本试验以平邑甜茶幼苗为材料，探究H2S能否缓解Cd胁迫对平邑甜茶幼苗根系造成的损伤，利用外源Ca2+以及Ca2+螯合剂EGTA、质膜Ca2+通道阻断剂La3+和钙调素拮抗剂CPZ，研究了平邑甜茶幼苗活性氧代谢和线粒体特性的变化，以研究证明Ca2+在H2S介导重金属胁迫信号传导中的作用，从而为提高果树抗逆应用研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与处理

精选饱满、均匀的平邑甜茶种子，用饱和漂白粉溶液消毒15 min，蒸馏水洗净后浸泡24 h，4 ℃冰箱层积35 d，待种子露白后，播种于12 cm×18 cm营养钵，基质为草炭、珍珠岩和蛭石按照3∶1∶1的比例配制。每钵播种2粒种子，待幼苗长至5～6片真叶，选取整齐一致的幼苗移入Hoagland营养液(pH值6.5)中进行水培，每2 d更换一次营养液。当幼苗生长至12～13片真叶时，用硫酸镉(CdSO4，200 μmol/L)处理，同时在营养液中加入H2S供体硫氢化钠(NaHS，购自Sigma公司)或氯化钙(CaCl2)/钙抑制剂处理，钙离子专一螯合剂为EGTA，钙离子通道阻断剂为LaCl3或钙调素拮抗剂为CPZ。

试验处理为对照CK：正常营养液；T1：200 μmol/L Cd胁迫处理；T2：200 μmol/L Cd+200 μmol/L NaHS处理；T3：200 μmol/L Cd+200 μmol/L NaHS+10 mmol/L EGTA处理；T4：200 μmol/L Cd+200 μmol/L NaHS+50 μmol/L LaCl3处理；T5：200 μmol/L Cd+ 200 μmol/L NaHS + 50 μmol/L CPZ处理；T6：200 μmol/L CdSO4+10 mmol/L CaCl2处理。每处理3次重复，处理后第2天取根系进行活性氧代谢和线粒体特性等生理指标测定；处理后第8天取幼苗植株测定株高、茎粗和干鲜质量等生长指标。采用软件 SPSS和Excel 2010进行数据统计分析和图表绘制。

1.2 测定方法

植株生物量测定：株高(茎基部到生长点)用直尺测量；茎粗(茎基部)用游标卡尺测量；地上部和地下部鲜质量、干质量用称量法和烘干法测量。

根系细胞死亡的测定参照Steffens和Sauter的方产生速率、H2O2含量、MDA含量、SOD、POD和CAT活性测定参照赵世杰等[16]的方法。

线粒体的提取和线粒体特性检测参照苏宏等[17]的方法。线粒体膜通透性的检测：配制缓冲液(220 μmol/L甘露醇，70 μmol/L蔗糖，4.2 μmol/L琥珀酸钠，pH值7.2)制备线粒体悬浮液，并用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量后调整悬浮液蛋白浓度为0.3 mg/mL，将悬浮液置于20 ℃恒温箱中保温2 min后，紫外分光光度计检测540 nm处的吸光度变化。线粒体膜电位测定：配制缓冲液(250 μmol/L蔗糖，2 μmol/L Hepes，0.5 μmol/L KH2PO4，4.2 μmol/L琥珀酸钠，pH值7.4)制备线粒体悬浮液，并调整悬浮液蛋白浓度为0.3 mg/mL。加入罗丹明123(1 mg/mL)在25 ℃恒温箱中保温30 min孵育后，荧光分光光度计(激发波长为505 nm，发射波长为534 nm)上检测荧光强度，每个样品测定3次，每次间隔5 min，样品荧光强度取3次的平均值。线粒体细胞色素c/a测定：用牛血清白蛋白(0.2 %)制备线粒体悬浮液，调整悬浮液蛋白含量为0.5 mg/mL。紫外分光光度计检测550 nm和630 nm处的吸收值，2种波长的吸收值之比即为Cyt c/a。

2 结果与分析

2.1 Ca2+和H2S对Cd胁迫下平邑甜茶幼苗生长的影响

如表1所示Cd胁迫导致平邑甜茶幼苗的株高、茎粗、地上部干、鲜质量，地下部干、鲜质量显著下降，明显抑制幼苗生长。Cd胁迫下分别添加外源H2S供体NaHS和CaCl2均缓解了Cd对幼苗生长的抑制，株高、茎粗和植株干鲜质量均显著增加，二者缓解水平相当；Cd胁迫下添加NaHS的同时添加钙离子专一螯合剂EGTA，钙离子通道阻断剂LaCl3或钙调素拮抗剂CPZ抑制了外源H2S对平邑甜茶幼苗生长的缓解作用，株高、茎粗、地上部干质量和地下部干、鲜质量都比Cd胁迫下仅添加NaHS的显著下降(表1)。

注：同列数值后不同字母表示差异性达5%显著水平。图1-4同。

Note：Different letters within the same column indicate significant difference at 5% level. The same as Fig.1-4.

2.2 Ca2+和H2S对Cd胁迫下平邑甜茶幼苗根系细胞死亡的影响

伊文思蓝(Evans blue)是可透过受损的细胞膜将细胞染成蓝色的非侵透性染料，被细胞截留的伊文思蓝量可用来反映细胞的受损程度，染色越深根系活力越低，死亡细胞数量越多[3]。如图1所示，200 μmol/L CdSO4处理平邑甜茶根系48 h，可导致根系细胞截留伊文思蓝量显著增加，说明大量根系细胞死亡。Cd胁迫下添加NaHS，在外源H2S的作用下，根系细胞死亡数量比单独Cd处理降低了40.4%。Cd胁迫下添加外源Ca2+也降低了根系细胞死亡数量，与Cd+NaHS处理的水平相当，而比单独Cd处理的降低了39.3%，差异显著。而Cd胁迫下添加NaHS的同时添加EGTA、LaCl3或CPZ的处理根系细胞死亡数量又高于Cd+NaHS的处理。

2.3 Ca2+和H2S对Cd胁迫下平邑甜茶幼苗根系产生速率、H2O2和MDA含量的影响

图2-A表明，Cd胁迫显著提高了幼苗根系产生速率(以鲜质量计)。Cd胁迫下增加外源H2S显著抑制了根系产生，产生速率比单独Cd处理的降低了44.9%；而Cd胁迫下添加NaHS的同时添加EGTA、LaCl3或CPZ处理的产生速率又高于Cd+NaHS的处理。Cd胁迫下添加外源Ca2+也显著降低了产生速率，比单独Cd处理的降低了60.5%，比Cd+NaHS处理的水平进一步降低，且差异显著。

由图2-B可知，相同处理下，平邑甜茶根系H2O2含量(以鲜质量计)变化与超氧阴离子产生速率的变化基本一致：Cd胁迫下，根系活性氧爆发，H2O2含量保持在较高水平；Cd+NaHS和Cd+CaCl2处理的H2O2含量分别比单独Cd处理的显著降低了30.7%和29.6%，二者水平相当；Cd+ NaHS+EGTA、 Cd+NaHS+LaCl3 或Cd+NaHS+CPZ处理的H2O2含量比Cd+NaHS处理的又分别提高了30.3%,24.0%和30.0%，差异显著。

Cd胁迫下，苹果幼苗根系内MDA含量(以鲜质量计)显著提高，比对照增加了45.0%；添加外源H2S显著缓解了Cd胁迫下MDA在根系中的积累，MDA含量比单独Cd胁迫处理降低了25.9%；Cd+ NaHS +EGTA、 Cd+ NaHS +LaCl3 或Cd+NaHS+CPZ处理抑制了单独H2S的作用，与单独Cd胁迫处理水平相当。Cd胁迫下添加外源Ca2+也抑制了MDA产生，MDA含量比单独Cd胁迫处理降低了16.8%(图2-C)。

2.4 Ca2+和H2S对Cd胁迫下平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性的影响

Cd胁迫条件下，平邑甜茶幼苗根系SOD活性(以鲜质量计)明显升高，比对照高74.7%。Cd胁迫下添加NaHS或CaCl2处理的均进一步提高了根系SOD活性，分别比Cd单独处理的增加了31.8%和41.5%。Cd+NaHS+EGTA、Cd+NaHS+LaCl3 或Cd+NaHS+CPZ处理的抑制了H2S的作用，SOD活性较Cd+NaHS处理的显著下降，与单独Cd胁迫处理水平相当(图3-A)。

由图3-B、C可知，POD和CAT活性(以鲜质量计)的变化趋势与SOD相似，即Cd胁迫下显著高于对照，Cd+ NaHS和Cd+CaCl2处理的进一步提高，Cd+NaHS+EGTA、Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ处理的显著抑制了H2S的作用，与单独Cd胁迫处理水平相当。

2.5 Ca2+和H2S对Cd胁迫下平邑甜茶幼苗根系线粒体特性的影响

线粒体膜通透性转变通道(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放程度决定膜通透性(MPT)的转变，MPTP的过度开放使MPT不断增大，线粒体膜蛋白在540 nm处的吸光度减小。如图4-A，在单独Cd处理下根系线粒体膜蛋白吸光度显著低于对照。Cd胁迫下NaHS或CaCl2处理稳定了Cd胁迫下根系线粒体膜的通透性，Cd+ NaHS和Cd+CaCl2处理下MPTP开放程度分别比Cd处理降低了21.0%，18.8%。Cd+NaHS+EGTA、Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ处理的不同程度上抑制了H2S的作用，其中Ca2+专一螯合剂EGTA，Ca2+通道阻断剂LaCl3的抑制效果显著，MPTP开放程度比Cd+NaHS处理的又分别提高了9.72%和9.14%。钙调素拮抗剂CPZ抑制效果稍差，MPTP开放程度比Cd+NaHS处理的提高了8.02%。

线粒体膜电位(Δψm)是评价线粒体功能的特征指标，MPTP的过度开放会导致Δψm不可逆地改变。Cd处理的根系线粒体Δψ与对照相比显著降低。Cd胁迫下添加NaHS提高了线粒体Δψ，与单独Cd处理差异显著；Cd胁迫下添加NaHS的同时添加Ca2+专一螯合剂EGTA，Ca2+通道阻断剂LaCl3和钙调素拮抗剂CPZ抑制了H2S的作用，根系线粒体Δψ与Cd+NaHS处理的均差异显著。Cd胁迫下添加外源Ca2+处理的根系线粒体Δψ与Cd+NaHS处理的水平相当(图4-B)。

与对照相比，在Cd处理下，随着MPTP 开放程度的增大，Δψm的降低，Cyt c/a 也显著降低。与单独Cd胁迫相比，Cd+ NaHS和Cd+CaCl2处理显著提高了根系线粒体Cyt c/a。而Cd胁迫下添加NaHS的同时，添加钙离子相关抑制剂均显著抑制了H2S的缓解作用，其中Cd+ NaHS +CPZ处理的抑制效果最明显，Cyt c/a比Cd+NaHS处理降低了29.9%(图4-C)。

3 讨论

已有研究发现，在较严重的胁迫条件下，线粒体是响应逆境信号的初始位点，通过启动一系列代谢过程来增强植物的环境适应[17]。镉胁迫下连接线粒体内外膜的MPTP过度开放，使线粒体膜MPT不断增大，导致呼吸链解偶联，Δψm下降甚至消失，松散得结合在线粒体内膜上的Cyt c穿过线粒体膜进入细胞质。Cyt c是线粒体电子传递的组成成分，它的脱落破坏线粒体抗氧化防御体系，导致ROS和MDA等物质的大量产生，诱导细胞死亡，使细胞正常生理代谢受阻，幼苗生长受到明显抑制[3]。

近年来越来越多的证据表明，H2S可以通过调节抗氧化酶活性和非酶类物质含量，清除细胞内过量的ROS，缓解逆境对细胞的氧化损伤[6-7，11]。但H2S对植物遭遇镉胁迫后的线粒体功能是否具有调节作用未见报道。本试验中在镉胁迫下添加NaHS处理可显著减少平邑甜茶幼苗根系细胞的死亡数量，减轻Cd对幼苗生长的抑制。这可能是由于外源H2S可有效提高线粒体的完整性，抑制线粒体内ROS的产生；同时H2S激活了抗氧化酶系统，SOD、CAT、POD活性增强，使产生的ROS能很快被还原，减轻Cd胁迫引起的膜脂过氧化对线粒体膜的伤害和对电子传递链的阻抑，保护了线粒体功能，缓解伤害。

植物在受到非正常刺激时，可以通过细胞质膜上Ca2+通道的开放或细胞内钙库的Ca2+释放提高细胞质基质中的Ca2+水平，从而形成Ca2+信号，引发系列生理生化代谢[18-19]。已有研究表明，一定浓度的外源Ca2+处理可以有效提高大蒜对镉胁迫的抗性及葡萄对光氧化胁迫的适应[20-21]。本研究中，Cd胁迫下添加外源Ca2+处理减小了根系MPTP 的开放程度，显著提高了根系线粒体的Δψm和抗氧化酶活性，使ROS的水平显著低于单独Cd处理，膜脂过氧化保持在较低的水平，最终缓解了Cd胁迫对幼苗生长的抑制。但添加NaHS的同时添加钙离子专一螯合剂EGTA，钙离子通道阻断剂LaCl3或钙调素拮抗剂CPZ后，外源H2S的作用被解除。这是因为逆境下胞外Ca2+通过Ca2+通道的激活进入胞内，引起胞质Ca2+浓度瞬间增加，Ca信号与其靶蛋白CaM结合成Ca2+-CaM启动复杂的信号转导体系，导致植物做出相应的应答反应[22]。本试验中，当Ca2+被EGTA螯合、Ca2+通道被LaCl3抑制及Ca2+-CaM的生成被CPZ抑制时，Ca2+的信号传导被阻断，使Ca2+对植物体的生理功能被解除。这表明，Ca2+在H2S诱导的保护酶活性增强，线粒体功能稳定，活性氧清除能力提高，膜脂过氧化降低，从而缓解镉胁迫伤害的过程中起重要作用，而H2S的作用可能依赖于Ca2+。植物响应逆境的信号传导是复杂的网络系统，可能存在多种交叉对话，在某个地方汇集启动Ca2+依赖或非依赖性的信号传导途径，因此，明确H2S和Ca2+的作用需要进一步的试验支持。

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