猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，为已知最小的动物病毒之一，圆环病毒分为感染鸟类和感染哺乳动物类2种，感染哺乳动物类的即为猪圆环病毒。猪圆环病毒的基因组为单股负链的闭合环状结构，大小为1.7～2.0 kb[1-2]。基因组为双义链，正义链和反义链均可以编码蛋白 [3]。PCV分为2个血清型：Ⅰ型(PCV1)和Ⅱ型(PCV2)，其中，PCV1无致病性，而PCV2则是多种猪病的病原体 [4]。目前，已知和PCV2相关的猪病有：猪断奶后衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性产颤抖、肠炎等 [5]。PCV2病毒因有存活能力强、传播范围广、易诱发其他疾病共感染的特点而给全球的养猪业造成了严重的危害。
已有报道，PCV2可通过MyD88-NF-κB途径调节IL-4和IL-12的分泌，研究发现，PCV2可通过激活MyD88启动NF-κB信号途径，通过IκBα的磷酸化降解激活NF-κB，促使其入核与DNA结合，调控相关细胞因子的转录和表达 [6-7]。PCV2感染肺巨噬细胞后，TNF-α、IL-8分泌量会下降 [8]，且巨噬细胞趋化因子Ⅱ(Macrophage-derived chemotactic factor-Ⅱ，AMCF-Ⅱ)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、单核细胞趋化因子(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的mRNA表达量均会一定程度下调 [9]。Darwich等 [10]研究表明，PCV2的核酸以及基因组的特殊结构(ODN)可抑制PBMCs中IFN-α、IL-12p40、IL-10和IL-6的表达。综上可知，PCV2对宿主的先天性免疫存在潜在的调控作用，但PCV2对作为介导天然免疫反应重要防线的β干扰素是否也具有调控作用，目前未见报道。
病毒感染细胞后，释放核酸，被胞浆中特异的模式识别受体识别，经过相应配体的结合和下游信号转导，启动干扰素和其他细胞因子基因的转录 [11-12]。TLR9是发现较早的病毒DNA模式识别受体，AIM2、IFI16、DDX41、cGAS是后来逐渐发现的其他胞质DNA感受器 [13-16]。通过模式识别受体对病毒DNA的识别引发级联反应，最终同IFN-β上游的-100～-50 bp处启动子区有顺式作用元件(Positive regulatory domain，PRD)相应的ISRE、NF-κB、AP-1启动子区结合，启动IFN-β [17]。
本研究利用 IFN-β启动子报告基因检测、相对荧光定量等试验方法，探究PCV2调控Ⅰ干扰素通路的作用机制，为该病的防治提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验所有PCV2毒株为天津大学生命科学学院实验室在PK-15细胞上增殖后收集保存，所用PK-15细胞为本实验室冻存。真核细胞表达载体pcDNA3.1、RIG-I-FLAG、IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、ISRE-Luc质粒、TBK1表达质粒、IRF3-5D-Flag、仙台病毒(Sendai virus，SEV)由本实验室保存。
1.2 主要试剂
TRIzol LS reagent、DEPC购自Invitrogen公司；TranScript First-Strand cDNA Synthessis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；分子克隆相关试剂：E.coli DH5α感受态、Fast pfu DNA聚合酶购自全式金公司；限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ、T4DNA连接酶均为New England Biolabs公司产品；无内毒素质粒大提试剂盒购自Promega公司；细胞培养相关试剂：FBS、PBS、青-链霉素、0.25%胰酶、DMEM 培养基购于Gibco公司；转染试剂Lipofectamine 2000 Reagent购自ThermoFisher 公司。荧光素酶报告检测试剂：D-Luciferase粉末购自Sigma公司；Glycylglycine购自北京索莱宝科技有限公司；鼠抗HA标签单抗、鼠抗β-actin 单抗、兔鼠抗-V5 标签单抗、辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体购自全式金公司。
1.3 试验方法
1.3.1 细胞与病毒增殖 细胞培养于含有10% FBS 和1%青-链霉素的H-DMEM 完全培养基中，置于37 ℃，5% CO2孵箱中培养。PCV2毒株按MOI为0.5感染PK-15细胞及PAM细胞，感染后2，6，12，24，36，48 h分别收集细胞，提取总RNA，相对荧光定量PCR检测PCV2感染不同时间先天性免疫分子的变化。相对荧光定量PCR体系为：总RNA(50 ng)8 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，Oligo(dT) 18 (50 pmol/L) 1 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，ddH2O 8.2 μL，反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃ 30 s，共进行40个循环。95 ℃持续15 s，60 ℃ 15 s，升温至95 ℃持续20 min，采集扩增产物的解链曲线。相对荧光定量PCR中的Ct值代表模板中目标基因的含量，通过与β-actin进行比较，细胞因子mRNA相对定量PCR结果采用2-ΔΔCt法进行分析。利用Duncan法进行统计学分析(P<0.05时表示差异显著)。
1.3.2 质粒构建、转染及蛋白检测 根据GenBank(DQ910866.1、DQ235696.1、EF514716.2)基因序列设计PCV2 ORF1、ORF2、ORF3基因扩增引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用浓度25 pmol/μL的引物见表1。根据相应基因序列设计引物，将PCV2 ORF1、ORF2、ORF3基因连接到pcDNA3.1真核表达载体上，将一定量的质粒转染HEK293T细胞，转染48 h后收获细胞，加入适量含蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，150 mmol/L NaCl，1%NP-40)冰浴裂解30 min，裂解液于4 ℃、8 000 r/min离心5 min，收集上清进行 SDS-PAGE，之后将蛋白转膜至硝酸纤维膜上，经5%牛奶封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记二抗室温孵育1 h后，用化学发光显色底物及Chemi Doc TMXRS系统检测。
表1 PCV2基因扩增引物
Tab.1 Amplification primers of different PCV2 protein genes
扩增基因AmplificationgeneGenBankNo．引物Primers产物长度/bpProductlength退火温度/℃AnnealingtemperaturePCV2ORF1DQ910866．1F：GCTCTAGAACCTCAGCAGCAAC94556．1R：CGGGATCCGTAATTTATTTCATATGGAAATTCPCV2ORF2DQ235696．1F：CACTGGACTAGTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC70257．5R：ACCGAGCTCGGAGGATCCAGGTTTAAGTGGGGGGTCTPCV2ORF3EF514716．2F：CACTGGACTAGTGGATCCATGATGAGATTTAATATTGACGAC34552．8R：ACCGAGCTCGGAGGATCCGCCAAAGCTGATTCCTTTT
注：灰色部分为酶切位点。
Note：Enzyme cutting site was showed in gray.
1.3.3 荧光素酶报告检测 将IFN-β启动子荧光素酶的报告质粒 IFN-β-Luc和荧光素酶内参质粒 Laz-luc共转染PK-15细胞，设置不接种(Mock)和接种PCV2(0.5 moi)组，并将PK-15细胞接种SeV作为阳性对照，24 h后检测 IFN-β启动子荧光素酶活性。为了进一步研究PCV2感染是否能抑制Poly(dA∶dT)诱导的IFN-β转录，将 IFN-β启动子荧光素酶的报告质粒IFN-β-Luc和荧光素酶内参质粒Laz-luc共转染PK-15细胞，随后分别设0.00(Mock)，1.00，0.10，0.01 moi剂量的PCV2接种组，接种设置为24 h后用Poly(dA：dT)刺激，24 h后检测 IFN-β启动子荧光素酶活性。
为了进一步研究PCV2编码的3个主要蛋白ORF1/ORF2/ORF3哪个对干扰素具有调控作用，使用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1-ORF1、pcDNA3.1-ORF2、pcDNA3.1-ORF3各0.5 μg同0.5 μg IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、AP-1-Luc及0.5 μg 内参Laz-luc质粒共同转染24孔板中的HEK293T细胞，转染24 h后，加入SEV(20 HA/mL)刺激18 h后收集细胞，进行荧光素酶报告检测。确定了PCV2编码蛋白对干扰素具有调控作用后，进一步将0.5 μg IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、AP-1-Luc与0.5 μg 内参Laz-luc质粒同不同剂量的pcDNA3.1-ORFs(0.05，0.10，0.20，0.40 μg)转染细胞，用Poly(dA∶dT)或cGAS质粒作为诱导剂激活干扰素信号通路。
数据平均值和标准误差通过GraphPad Prism 5.01分析处理得到。通过t检验计算P值，P值小于0.05时认为有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 pcDNA3.1-ORF1/ORF2/ORF3真核表达的构建
基因扩增产物与目的大小相符，阳性克隆测序正确，表明已成功构建了ORF1/ORF2/ORF3的pcDNA3.1真核表达载体。重组质粒转染细胞裂解产物的相对分子量大小正确，能特异性表达相应大小的ORF1/ORF2/ORF3蛋白(图1)。
A.ORF1-3基因片段分别为945，702，345 bp；B.ORF1-3表达蛋白分子量分别为37.8，27.5，13.5 ku。A.ORF1-3 PCR products，945，702，345 bp respectively；B.The expression products of PCV2 ORF1-3，37.8，27.5，13.5 ku，respectively.
图1 PCR扩增PCV2 ORF1、ORF2、ORF3基因的产物(A)及其pcDNA3.1-ORF1/ORF2/ORF3转染HEK293T细胞的表达蛋白(B)
Fig. 1 The PCR amplification products of PCV2 ORF1，ORF2 and ORF3 genes (A)and its expression protein in transinfected HEK293T cells (B)
2.2 PCV2体外感染对天然免疫反应的抑制效应
2.2.1 PCV2感染对白细胞介素mRNA的影响 如图2所示，整体上看，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的转录在病毒感染初期会有一个上升过程，但在感染后期均会受到不同程度的抑制。IL-1β和IL-8是天然免疫应答过程中最重要的调节因子，其参与炎症反应、增强免疫介导的组织损伤；IL-8是一种重要的趋化性细胞因子，趋化和激活中性粒细胞、嗜碱性粒细胞及T细胞进入感染部位。PCV2感染后IL-8在12 h的升高说明病毒成功感染细胞，后期可能与细胞浸润和肉芽肿形成相关；IL-10是一种介导免疫抑制的细胞因子，可以抑制Th1细胞应答、抑制巨噬细胞的抗原提呈功能及其细胞因子的合成，PCV2感染导致IL-10转录的上调和感染猪胸腺的衰竭有关。
图2 PCV2感染PK-15细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10转录时相
Fig.2 The transcriptional profiles of cytokines IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10 in PCV2 inoculated PK-15 cells
2.2.2 PCV2感染对抗原提呈分子mRNA的影响 如图3所示，PCV2感染后MHCⅠ、MHCⅡ类分子在感染早期的转录水平较高，其中，MHCⅠ的峰值出现在感染后12 h，MHCⅡ则能持续较高水平地表达，在感染24 h后开始下降。抗原提呈细胞后期受到抑制可能和IL-10的高水平表达有关，IL-10的上调会降低MHC类分子的表达，损害抗原提呈细胞的抗原提呈能力。
图3 PCV2感染PK-15细胞MHCⅠ，MHC Ⅱ的转录表达
Fig.3 The transcriptional changes of MHCⅠand MHCⅡ in PCV2 infected cells
2.2.3 PCV2感染对模式识别受体TLRs、cGAS的影响 TLR样受体是一种广泛存在的模式识别受体，其中，TLR3、TLR7、TLR9主要负责识别病毒的核酸，我们已经证实，PCV2感染会引起先天性免疫细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等的变化，这种变化是否和TLR受体相关？PAM细胞感染PCV2后0，6，12，24，48 h各时间点收集细胞，提取总RNA，利用相对荧光定量的方法检测TLR3、TLR7、TLR9的mRNA水平，结果如图4所示。在PCV2感染12 h以内TLRs的转录水平不会有显著的变化，但在感染12 h以后便开始显著升高，其中，TLR7随感染时间变化不明显，TLR9有先上升后下降的趋势，在24 h时达到最大值，随后开始下降(图4)。
图4 PCV2感染对TLR3/7/9、cGAS转录的影响
Fig.4 The transcription levels of TLR3/7/9 and cGAS in PCV2 inoculated cells
2.2.4 PCV2体外感染对Ⅰ型干扰素及转录因子的影响 Ⅰ型干扰素是机体天然免疫重要的抗病毒蛋白。对PCV2感染后细胞Ⅰ型干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ的转录水平进行动态分析发现，PCV2感染对IFN-α的影响不明显，但可以下调IFN-β、IFN-γ的mRNA，转录因子NF-κB上调，而IRF3的转录水平被下调(图5)。
图 5 PCV2感染PK-15细胞后Ⅰ型干扰素及转录因子NF-κB、IRF3转录的变化
Fig.5 The transcription levels changes of type Ⅰ interferon and transcription factor NF-κB and IRF3 in PCV2 inoculated cells
2.2.5 PCV2体外感染PK-15对IFN-β及其启动子的抑制 IFN-β是先天性免疫的第一道防线，采用荧光素酶报告检测系统检测PCV2感染PK-15细胞后IFN-β的表达情况及其启动子的激活情况，分别用DNA模式识别受体相关的配体去激活IFN-β信号通路，然后检测PCV2感染后对IFN-β的影响(图6)，结果显示PCV2感染不能激活IFN-β的转录，并且能够抑制Poly(dA∶dT)、cGAS诱导的IFN-β转录，且呈现接种剂量依赖性。
A.与Sev相比；B.PCV2剂量效应；C.不同激活配体处理；*.P<0.05，**.P<0.01。图7-9同。A.Sev stimulated cells；B.Dose-dependent effect of PCV2 treated cells；C.PCV2 blocked Ploy(dA∶dT)，cGAS induced activity of IFN-β.*.P<0.05,**.P<0.01.The same as Fig.7-9.
图6 PCV2感染对IFN-β-Luc通路及IFN-β转录的影响
Fig.6 Effect of PCV2 infection on the IFN-β-Luc pathway and the IFN-β transcription level
2.3 PCV2 ORF1、ORF2对IFN-β的调控作用
为了确定PCV2 ORF1、ORF2、ORF3这3个主要蛋白的调控作用，将PCV2表达质粒ORF1、ORF2、ORF3分别同IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、IRF3-Luc、AP-1-Luc质粒共转染细胞，24 h后加入Sev作为诱导剂激活IFN-β通路。如图7所示，PCV2感染抑制Poly(dA∶dT)和cGAS诱导的IRF3、NF-κB的活化，但不影响AP-1的活化。ORF1可以通过NF-κB启动子激活IFN-β的表达，ORF2可通过NF-κB和IRF3启动子抑制IFN-β的表达，ORF3则没有明显的作用。
图7 不同PCV2 ORF表达蛋白对干扰素诱导启动子活化的影响
Fig.7 The regulation roles of different PCV2 ORF expression protein in inducing IFN activation
2.4 ORF1 和ORF2通过NF-κB、IRF3对IFN-β的作用
PCV2感染可以抑制Ploy(dA∶dT)、cGAS诱导的IFN-β产生，且呈剂量依赖关系。以cGAS为诱导剂检测过表达ORF1、ORF2时，对IFN-β及其启动子的活性调控的结果如图8所示，ORF1可以通过NF-κB启动子激活IFN-β的表达，并且呈剂量依赖效应；ORF2可以通过NF-κB和IRF3启动子抑制IFN-β的表达，并且呈剂量依赖效应。
水泡性口炎在许多细胞上都有它的受体，因此可以感染多种细胞系，并且已知它是一种对Ⅰ型干扰素敏感的病毒。笔者用表达绿色荧光蛋白标记的水泡性口炎病毒(GFP-VSV)间接判断ORF1、ORF2表达蛋白对细胞干扰素产生的影响，生长状态良好的PK-15细胞，分别转染ORF1、ORF2的表达质粒，转染24 h后，按moi 0.01的浓度接种GFP-VSV。接种后18 h收获细胞，用4%的多聚甲醛固定细胞后，用DAPI染细胞核，荧光倒置显微镜观察视野中GFP-VSV的细胞数量并做统计学分析，结果如图9所示，ORF1转染细胞VSV-GFP病毒增殖明显受到抑制，ORF2转染细胞后VSV-GFP病毒的增殖却显著增强。
图8 PCV2 ORF1和ORF2影响的干扰素活化途径分析
Fig.8 Effects of over expression of PCV2 ORF1/ORF2 on cGAS-triggered IFN-β promoter activation
A、B.ORF1 转染组；C、D.ORF2 转染组。A，B.ORF1-treated cells；C，D.ORF2-treated cells.
图9 不同PCV2 ORF表达蛋白对GFP-VSV增殖的影响
Fig.9 The effects of different PCV2 ORF expression protein on GFP-VSV multiplication
3 讨论
PCV2感染PK-15细胞检测其对细胞先天性免疫因子的影响，结果发现，NF-кB、IL-6、IL-8细胞因子在病毒感染后其转录水平均较高，而IFN-β、IL-1β、TNF-α、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ细胞因子后期受到抑制[18]，说明PCV2造成感染细胞的免疫抑制，这也解释了感染PCV2的仔猪通常会伴随着猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪肺炎支原体、细菌性败血症和肺炎等其他疾病，PCV2感染造成机体免疫抑制使得仔猪继发性易感性增加。病毒感染使TLRs转录水平试验中TLR3的转录水平随PCV2感染会升高，可能的原因为细胞的RNA聚合酶Ⅲ以PCV2基因组为模板合成5′-三磷酸双链RNA，它可被TLR3识别，进而通过TRIF途径发挥抗病毒效应，但对TLR7的转录水平没有影响。TLR9识别病毒非甲基化的CpG DNA，通过对PCV2的序列分析发现，PCV2基因中富含若干CpG DNA基序可以激活TLR9，PCV2感染后24，36 h TLR9 mRNA表达量升高，可能与PCV2基因组中CpG的释放内陷进入细胞内有关。
病毒感染机体后，机体的细胞内模式识别受体会识别和提呈病毒的病原相关分子，启动天然免疫，经一系列的信号转导，最终诱导Ⅰ型干扰素等细胞因子的表达，这是很多病毒用来逃逸先天性免疫的主要手段之一[19]。研究发现，仙台病毒(Simaian virus)的V蛋白、埃博拉病毒(Ebola virus)的VP35可以通过抑制IRF3的功能从而抑制干扰素的转录，到达逃逸先天性免疫的目的。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)NS3/4A既可以抑制IRF3的功能，也可以通过降解MAVS蛋白来抑制先天性免疫；流感病毒的非结构蛋白NS1可以通过和RIG结合而抑制IRF3的功能，从而成功地进行免疫逃逸。HCV的NS5A蛋白通过抑制MyD88、痘病毒(Vaccinia virus)的A52R通过与IRAK2的相互作用抑制TLR介导的Ⅰ型干扰素转录[19-22]。研究发现，PCV2通过IRF3、NF-κB启动子抑制干扰素的产生，但PCV2 ORF1和ORF2在对干扰素的调控方面表现出相反的特性，ORF1通过NF-κB激活干扰素的产生，Meng[23]研究发现，PCV2 复制时激活 NF-κB，细胞用NF-κB抑制剂处理可以减少病毒的复制，说明NF-κB 的活化在协同多种控制免疫反应的细胞基因表达上发挥重要的作用，从而促进病毒的复制。现在还不清楚其具体分子机制。另有研究表明，PCV2基因序列中含有的干扰素刺激应答元件(ISRE)使得PCV2感染早期能够利用干扰素进行病毒复制[24]。这可能为ORF1激活IFN-β提供了一种解释。
IRF-3被上游信号分子激活后磷酸化入核，再与细胞核内的组蛋白乙酰基转移酶结合，改变染色体的构象，然后与干扰素启动子DNA结合，通过这一系列的活化过程来启动干扰素的表达。NF-κB的活化包括IκB降解和P65磷酸化2个过程，IκB降解后释放NF-κB P50/P65异源二聚体，P65磷酸化，最终进入细胞核与细胞核内的组蛋白乙酰基转移酶结合，改变染色体的构象，然后与干扰素启动子DNA结合，启动干扰素的表达[25-26]，因此，欲进一步研究ORF1/ORF2调控干扰素的机制，需要研究ORF1/ORF2对IRF3的磷酸化二聚化入核的影响[27-29]。
研究中利用双报告基因检测技术、相对荧光定量等试验方法，发现PCV2抑制Ⅰ型干扰素通路，但其编码的ORF1蛋白通过NF-κB激活IFN-β的产生，ORF2通过NF-кB、IRF3启动子抑制IFN-β的产生，这为认识PCV2免疫抑制机制提供了新依据。
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