甜菜双向电泳体系条件的优化

张辉1，2，白晨2，王华忠3，张惠忠2，李晓东2，付增娟2，赵尚敏2，鄂圆圆2，张自强2，王良2

(1.中国农业科学院，北京 100081；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031；3.中国农业科学院甜菜研究所，黑龙江哈尔滨 150080)

摘要：为了获得甜菜叶片双向电泳中蛋白质最佳提取方法，建立甜菜叶片蛋白质双向电泳最佳的双向电泳体系。以甜菜叶片为材料，通过比较分析，研究甜菜叶片总蛋白提取方法、IPG胶条pH 值及其对应上样量等因素对甜菜叶片蛋白质双向电泳结果的影响。结果表明：酚提取法、TCA/丙酮提取法和可溶性蛋白提取法3种蛋白提取方法中TCA/丙酮法提取效果较好，pH值4～7与pH值5～8的双向蛋白电泳比较发现：pH值4～7胶条蛋白点清晰且在图谱上的蛋白点分布均匀，无蛋白点集中现象，更适合甜菜叶片的蛋白质组分析。采用7 cm 线性固相 IPG 胶条进行双向电泳，150 μg上样量蛋白点明显增多，双向电泳效果更好，pH值4～7的17 cm胶条300 μg上样量胶点更多更清晰，试验结果为甜菜蛋白质组学的研究提供了最佳的试验方法。

甜菜是二年生作物，重要的糖料作物之一，主要分布在黑龙江、内蒙古和新疆3个地区。国家将粮、棉、油、糖作为重要的战略储备物资，糖料也是关系国计民生的重要物资。蛋白质组学(Proteomics)一词，源于蛋白质(Protein)与基因组(Genome)2个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。随着蛋白质组学技术体系的不断发展、不断完善，植物蛋白质组学快速发展。甜菜作为重要的糖料作物之一，开展甜菜蛋白质组学研究对研究相关的抗逆、高产、含糖具有重要意义。国内报道了对甜菜M14品系花器官进行了特异性表达蛋白质的研究[1]。开展了对甜菜叶片应答干旱胁迫处理进行的差异蛋白质组学分析[2]。对甜菜块根膨大过程的蛋白质组变化也进行了相关研究[3]。此外，对甜菜细胞质雄性不育系与保持系花期差异蛋白表达开展了研究[4]。范慧艳[5]在已有的研究基础上，对BNYVV侵染系统寄主烟草和甜菜的生物学、转录组学和蛋白组学特点进行比较分析研究。国外甜菜蛋白组学研究则在芽势变化[6]、抗旱性[7]、抗盐性[8]、育性[9]等方面有报道。但目前关于甜菜蛋白质组学的报道相对于其他作物还是较少，与甜菜双向电泳技术的不成熟有一定的关系。因此，本研究针对甜菜叶片总蛋白的提取方法，线性固相pH梯度(Immobilized pH gradient，IPG)胶条pH值、上样量等进行研究，建立了一套甜菜叶片蛋白质双向电泳技术方法，为甜菜蛋白质组研究提供理论依据和参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料与处理

试验材料为内蒙古农牧业科学院自育材料HB-1，于2014年6月20日播种，在内蒙古农牧业科学院自然条件下进行盆栽试验，将种子播种于直径20 cm、高25 cm的塑料盆内，每盆装3 kg土，定苗10株，盆栽每隔3 d浇一次自来水，每次250 mL。待真叶展开后6～8片叶时进行叶片取样，储存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2 总蛋白提取方法

采用以下3种方法进行，TCA/丙酮提取法[10]、酚提取法[11]、可溶性蛋白提取双乙法[12]。

1.3 蛋白质浓度测定体系

从浓缩后的蛋白干粉中取15 mg，向其中加入150 μL的蛋白裂解液复融。浓缩后的蛋白干粉很难溶解，可通过反复冻融的方法促进蛋白溶解。直到看不见蛋白颗粒为止。从上清液中取1 μL，稀释100 倍，用于测定蛋白含量。采用Bradford法定量蛋白[13]。

1.4 双向电泳条件的设定

选用不同pH值范围的IPG胶条进行对比，调整上样量比较双向电泳的清晰度，确定最佳的pH值范围及上样量，不同胶条长度的双向电泳比较。7 cm胶条和17 cm固相IPG胶条等电聚焦反应程序的设定如表1，2。

1.5 双向凝胶电泳及凝胶染色

第一向等电聚焦采用水化上样的方法；第二向SDS-PAGE凝胶电泳采用12%SDS-PAGE凝胶垂直板电泳；凝胶染色采用经典考马斯亮蓝染色。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白提取方法的比较

2.1.1 蛋白质检测蛋白质提取后采用Bradford法定量蛋白，取6支试管，编号后，按表3加入试剂，图1曲线计算提取蛋白的含量。将3种蛋白质提取方法提取的浓度适中的蛋白质进行垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳。图2为3种提取方法的垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳图。由图2可知，3种蛋白质提取方法在上样量均为15 μL的情况下，TCA/丙酮提取方法电泳后的蛋白质条带最为清晰，酚提取法较之颜色稍浅，可溶性蛋白提取法条带最浅。相比较TCA/丙酮提取方法效果更好。

2.1.2 不同蛋白质提取方法比较在上样量均100 μg、等电聚焦条件相同的情况下，比较了酚提取法、TCA/丙酮法和可溶性蛋白提取法3种方法。提取到的蛋白的双向电泳结果如图3显示：在pH值3～10的胶面上，用可溶性蛋白提取法提取的蛋白质2-DE图谱，蛋白点较模糊，分辨率低，有横纹干扰；酚提取法所得的2-DE胶图谱蛋白点较清晰，凝胶背景也较为干净，横竖条纹干扰较少；相比较下，TCA/丙酮法的蛋白点最为清晰，背景最干净。

2.2 双向电泳体系条件优化

2.2.1 7 cm固相IPG胶条条件优化 pH值3～10 的7 cm线性固相 IPG 胶条，上样量分别为50，100 μg，对提取的蛋白进行双向电泳。电泳结果显示(图4)：100 μg上样量蛋白点更多且图像更清晰，但是背景加深，条纹变明显。pH值4～7与pH值5～8的100 μg上样量双向蛋白电泳比较发现(图5)：pH值4～7胶条蛋白点较清晰且在图谱上分布较均匀，有少量蛋白点集中现象，更适合甜菜叶片的蛋白质组分析。对pH值4～7的7 cm线性固相 IPG 胶条上样量分别为100，150 μg进行双向电泳。pH值4～7胶条不同上样量比较发现(图6)：与100 μg上样量相比，150 μg上样量图谱的蛋白点数量较多，点更加清晰。因此，该样品7 cm线性IPG 胶条上样量150 μg较适合双向电泳分析。

2.2.2 17 cm固相IPG胶条条件优化由7 cm胶条检测pH值4～7的胶条胶点分布更均匀，因此17 cm胶条检测上样量即可。上样量分别上样200，250，300 μg。比较17 cm胶条和7 cm胶条双向电泳后的凝胶电泳图可知17 cm胶条的蛋白质胶点在胶面上分散更均匀。图7比较可知上样量200 μg胶点最少，而且颜色最浅，跟上样量过少不能完全平铺有关。250 μg较之胶点更清晰，而300 μg较250 μg胶点更加清晰。因此，17 cm胶条pH值4～7的最佳上样量是300 μg。

3 结论与讨论

本研究确定了甜菜叶片蛋白质双向电泳最佳的提取方法，优化了一向等电聚焦的条件，建立了甜菜叶片蛋白质双向电泳技术体系。为甜菜蛋白组学的研究提供了理论依据和参考。不同蛋白的提取方法直接影响了蛋白质的提取效果，而且不同作物之间的蛋白质的提取方法不同提取的蛋白质效果也不尽相同。许多作物都对蛋白质的提取方法及双向电泳体系的优化做了大量研究如棉花[14]、水稻[15]、大豆[16]、甘蓝型油菜[17]、甜瓜[18]、油菜[19]等。研究结果表明，不同作物之间最佳的提取方法不尽相同。本研究选取了3种蛋白质提取方法进行比较研究，其中TCA/丙酮提取法获得蛋白纯度最高，浓度适中，更适合甜菜叶片蛋白质的提取。其次是酚提取法，效果最差的是可溶性蛋白提取法。在双向电泳条件优化过程中本研究对IPG胶条的pH值、水化上样量进行了比较分析，发现双向电泳结果凝胶染色后蛋白质更多地集中在pH值4～7的区域，7 cm的IPG胶条水化上样量150 μg蛋白质胶点更加清晰，17 cm的IPG胶条水化上样量300 μg蛋白胶点更加清晰。蛋白质组学方法在近年来发展迅速，衍生了多种分析方法[20-21]。通过蛋白质组学的研究更能清楚地研究某些特定的表达变化，因此蛋白组学研究具有重要的意义。甜菜蛋白组学开展相对较少，与甜菜双向电泳体系不成熟有关，因此研究其中的试验方法和优化条件也有重要的指导意义，为甜菜蛋白组学研究提供一定的理论依据和参考。

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ZHANG Hui 1，2，BAI Chen2，WANG Huazhong3，ZHANG Huizhong 2，LI Xiaodong2，FU Zengjuan 2，ZHAO Shangmin 2，E Yuanyuan2，ZHANG Ziqiang2，WANG Liang2

(1.Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Huhhot 010031，China；3.Institute of Sugar Beet Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150080，China)

Abstract：In order to obtain the best extraction method of protein in two-dimensional electrophoresis of beet leaves and establish the best two-dimensional electrophoresis system. It took beet leaves as material. To study the effects of the extraction methods of total protein，the pH value of IPG strip，and the corresponding amount of sample on the results of two-dimensional electrophoresis of sugar beet leaves through comparative analysis.The results showed that TCA/acetone extraction method was better than the phenol extraction method and soluble protein extraction method. Comparing IPG strip of pH 4-7 with pH 5-8 in two-dimensional electrophoresis：Protein spots with pH 4-7 were clear and distributed uniform in the spectra，no protein concentrated.It was more suitable for proteomics analysis of sugar beet leaves.Using the 7 cm linear phase IPG strip，protein spots with 150 μg sample volume increased obviously and was better. Using the 17 cm strip of pH 4-7 with 300 μg sample volume protein spots were more clear.The study provided the theoretical basis and reference for the study of sugar beet proteomics.

Key words：Sugar beet；Protein extraction method；Two-dimensional electrophoresis；System optimization

作者简介：张辉(1985-)，男，河北沧县人，助理研究员，在读博士，主要从事甜菜遗传育种研究。

通讯作者：白晨(1959-)，男，内蒙古呼和浩特人，研究员，硕士生导师，主要从事甜菜遗传育种及分子育种研究。王华忠(1957-)，男，辽宁西丰人，研究员，博士，博士生导师，主要从事甜菜遗传育种与种质资源创新研究。