花生种子黄酮及多酚含量的生态差异分析

(华北作物种质资源教育部重点实验室，河北省作物种质资源实验室，河北农业大学农学院，河北保定 071001)

摘要：为探讨生态环境是否对花生种子黄酮及多酚产生影响，及两者变化与初生代谢物脂肪和总糖含量变化的相关性，选用全国广泛栽培的、种子黄酮及多酚含量具有极显著差异的花生品种16个，在多个试验点进行2年种植，鉴定种子总黄酮、总多酚、脂肪和总糖含量，结果表明，基因型效应显著影响花生种子黄酮及多酚含量，濮花23号为高TFC品种，豫花9327为高TPC品种。生态环境对花生种子黄酮及多酚含量具有极显著效应，合肥试验点为适于黄酮和多酚形成的种植区。此外，黄酮及多酚二次生代谢物与脂肪、可溶性蛋白和总糖等初生代谢物在地域间变化趋势年纪间不一致。

花生种子内含有丰富的黄酮、多酚类抗氧化次生代谢物，是一预防糖尿病、高血压等代谢类疾病的优选食物[1-6]。所以，花生种子内黄酮、多酚等功能型成分含量日益引起消费者的重视。其含量受地理、气候的影响，在次生代谢物含量丰富的中草药中，地理影响尤为明显。假香野豌豆中槲皮素类黄酮含量在沈阳市棋盘山(41°57′ N，123°38′ E)为 1.98 mg/g，在抚顺市新宾县(41°43′ N，125°02′ E)为17.86 mg/g[7]，两地纬度相距 14′。在异黄酮含量丰富的大豆中，其籽粒异黄酮总含量与纬度呈极显著正相关，存在优势生产区。年际间降水量亦影响黄酮含量，同一大豆品种在同一点连续年份种植，黄酮总含量年份间差异达极显著水平，最高值是最低值的近 3 倍[8-9]。分析已有研究结果表明，年度间花生籽仁黄酮、多酚含量存在差异，Wang 等 [10]于 2008-2009 年在美国 Georgia 的 Dawson(31°46′ N，84°26′ W)连续2年种植，鉴定美国花生核心种质的黄酮含量，102 份种质2年的平均黄酮含量分别为 19.02，16.2 μg/g。Mondal 等[11]在印度 Gauribidanur 试验地，2010，2011年连续2年种植由2个花生栽培种 VG 9514 与 TAG 24 杂交的 RIL 群体，2010 年总多酚含量为1.0～2.3 mg/g，2011 年为0.7～2.1 mg/g。2010 年总黄酮含量为0.11～0.50 mg/g，2011 年为 0.07～0.30 mg/g。而花生籽仁中黄酮、多酚含量在生产地间的差异不甚明了。花生种子内除次生代谢物受环境影响外，脂肪和糖等初生代谢物也具有生态差异，并且是花生品质的重要指标，黄酮和多酚等次生代谢物含量变化的同时，亦应关注脂肪和糖指标，明确各物质之间区域差异的关系，对各地高品质花生生产具有重要的指导意义。

本研究选用广泛种植的具有黄酮和多酚差异的花生品种，在不同纬度试验点种植2年，测定总黄酮(TFC：Total flavonoid content)、总多酚(TPC：Total polyphenol content)、脂肪(FC：Fat content)、总糖含量(TSC：Total sugar content)，以明确土质、纬度及年度间气候对黄酮、多酚含量的影响，并初步阐释生态环境对多酚和黄酮等次生代谢物含量与脂肪和糖等初生代谢物变化相关性的影响。

1 材料和方法

1.1 供试品种及试验点

16 个由山东、河南、河北、四川等省育成的供试花生栽培品种：山花9号、开农49号、濮花28号、濮花23号、濮9519、潍花8号、冀02-6、豫花9326、豫花9327、豫花9719、天府23号、花育24号、花育33号、花育31号、冀花8号、冀花7号。供试品种于2011年 6-9 月种植于安徽省合肥(31°51′N，117°17′E)、山东省潍坊(36°37′N，119°11′E)和河北省保定(38°51′N，115°28′E)等试验地，2012 年 6 -9 月增加河南省濮阳(35°42′N，115°02′E)和江苏省徐州(34°15′N，117°11′E)试验地。

1.2 TFC、TPC、FC、TSC的测定

取果壳内部变褐色的花生种子自然晾干，高速万能粉碎机粉碎，石油醚(沸程：60～90 ℃)反复抽提，按国标法 GB/T 14772-2008 计算粗脂肪含量。去掉脂肪后的样品用于测定 TFC、TPC 和 TSC。

花生种子TFC测定参照Chukwumah 等[12]的方法。以芦丁(RT：Rutin)为标准品。以每克花生籽仁重(FW：Fresh weight)中含有 RT 的毫克当量值表示TFC，即：mg/g。

花生种子中 TPC 测定参照Shem-Tov等[13]的方法，标准品为没食子酸(GA：Gallic acid)。以每克花生籽仁重(FW：Fresh weight)中含有GA 的毫克当量值表示TPC，即：mg/g。

水杨酸法测定种子总糖含量[14]。葡萄糖为标准品，葡萄糖购自上海千叶生物科技公司。

利用 SAS 编辑 ANOVA 程序及 Excel 进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 布点试验方差分析

对影响 TFC、TPC 的年份效应、地点效应、基因型效应，及各效应间互作效应进行F测验(表1)，结果表明，除地点效应及基因型×地点的2年效应外，影响 TFC 的各项效应均极显著，影响TPC 的各项效应为显著或极显著。影响FC及TSC的各项效应中涉及年份、地点的效应均极显著。

注：*、**.分别表示0.05 和0.01 的显著水平； -.表示显著性测验为不显著。

Note：*，**. Significant difference at the 0.05 and the 0.01 probability levels，respectively；-. No significance at the 0.05 probability level.

以上结果分析可知，环境和基因型对 TFC、TPC 均有影响。各项效应的相对重要程度见表 2。TFC、TPC 的各项效应中，涉及年份的效应值最大，影响 TFC 的各项效应依次是年份×地点>年份>年份×地点×基因型>基因型×年份>基因型>地点>基因型×地点；影响TPC的各项效应依次为年份>年份×地点>基因型×年份>年份×地点×基因型>基因型>地点>基因型×地点。生态环境中，年份×地点是影响 FC、TSC 的最大效应。所以，在评价花生品质性状时，除基因型差异因素外，需要参考种植点及当年的气象数据。

2.2 基因型间TFC、TPC、FC、TSC的差异

经2011年3个试验点和2012年5个试验点，共计8个试验环境的种植，各种质品质差异显著性分析结果表明(表3)，TFC、TPC(以鲜质量计)在参试品种间存在差异，濮花23号和豫花9326的TFC高于其他品种，两品种间无显著差异；豫花9327的TPC和豫花9719的FC高于其他品种。各品种TSC之间无显著差异。在本次试验的8个试验环境中，濮花23号种子TFC在2年的保定、潍坊和安徽试验点属于高含量，豫花9326种子TFC在2011年的3个试验点及2012年的濮阳、徐州、安徽试验点属于高含量。豫花9327种子TPC在2年的保定、潍坊试验点和2012年徐州、安徽试验点，共计6个试验环境中属于高含量。说明花生品种间具有稳定的TFC、TPC差异，培育稳定的高TFC、TPC花生品种是可行的。

注：不同的大、小字母分别表示0.01 和0.05 的差异显著水平。表4同。

Note：Values followed by a different capital,small letter are significantly different at the 0.01 and 0.05 probability levels，respectively.The same as Tab.4.

2.3 试点间花生籽仁 TFC、TPC、FC、TSC 区域生态差异分析

2011，2012 年各试验点间TFC、TPC、FC、TSC等品质差异见表 4，各试验点间TFC、TPC和FC差异极显著，2012 年，TSC在保定、濮阳、徐州间无显著差异，在4个品质中，TSC 受生态环境影响最小。合肥试验点TFC 在2年和TPC在2011年均极显著高于其他试验点，利于TFC和TPC的形成。试点在纬度上的排列顺序为保定<潍坊<濮阳<徐州<合肥，结果表明，TFC、TPC、FC、TSC与纬度变化趋势不明显，说明影响花生4个品质的因素不仅是温度、降水等由纬度引起的气候因素，与土壤质地等亦有密切关系。

2.4 年份间花生籽仁TFC、TPC、FC、TSC生态差异分析

TFC、TPC、FC、TSC 年度效应均极显著(表1)。各品种在各试点的TPC均为 2012 年极显著高于 2011 年(表5)。从试验结果推测年纪间温度、水分的微小变化影响花生TFC及TPC 的形成。各品种在各试验点的TPC 年纪间变化趋势一致，只是反应程度不同，认为高TPC花生生产栽培措施在品种间可通用。而各品种在各试验点的TFC年纪间变化趋势不一致，尤其是在潍坊试验点，10个品种为 2012 年高于 2011 年，有 6个品种是 2011 年高于 2012 年，说明花生品种间黄酮代谢过程基因表达对降水、温度变化的响应机制有异，高TFC花生生产栽培措施的制定有一定的品种针对性。

注：*、**.分别表示 0.05 和 0.01 的显著水平；+(-).2012年TFC(TPC)均值大于(小于)2011 年。

Note：*，**.Significant difference at the 0.05 and the 0.01 probability levels，respectively；+ (-).TFC(TPC)in 2012 was larger (smaller) than its in 2011.

2.5 试点间、年份间花生籽仁 TFC、TPC 变化与 FC、TSC 含量变化的关系

将各年各点 TFC、TPC、FC 和 TSC 按极显著差异大小进行比较(表4)。2011 年，TFC、TPC 2种次生代谢物含量与初生代谢物含量 TSC 均为合肥实验点最高，而另一初生代谢物 FC 在合肥的值最小。尤为突出的是 TFC，其在各点间的变化趋势与 TSC 完全相同，与 FC 相反。2012 年，合肥和徐州两试验点的 TFC 与 FC 极显著高于其他试验点，濮阳试验点极显著低于其他试验点，而 TSC 在合肥试验点极显著低于其他试验点。TPC 在各点间的变化有其独特的特点，徐州最高，保定最小。2年结果综合分析，环境因子中，影响黄酮与 FC、TSC 之间变化趋势的主要因子是降水和温度。影响多酚与 FC、TSC 之间变化趋势的是土质、气候等多种因素。

3 讨论

植物体内的次生代谢物含量受地理、气候、胁迫等外界环境影响大，黄酮、多酚比水杨酸、木质素等次生代谢物的遗传力强[15]。本研究结果表明，基因型差异是 TPC、TFC 差异的重要因子。追溯濮花 23 号、豫花 9326 和豫花 9327 等高 TFC、TPC 种质的育成系谱，发现其均含伏花生血统[16-18]，伏花生血统在濮花 23 号中经由徐州 68-4 遗传[18]，在豫花 9327 中经由郑 86036-19 遗传[16]，而在豫花 9326 中经由徐州 68-4 和郑86036-19 两亲本共同遗传[16]。但同样具有伏花生血统的花育 24 号的TFC极显著低于濮花23号和豫花9326[16]，其TPC显著低于豫花9327。高 TFC、TPC 基因在伏花生、徐州 68-4 和郑 86036-19 中的遗传模式，及濮花 23 号、豫花 9326 和豫花 9327 种质中黄酮、多酚合成过程中的基因表达模式有待深入研究。

土质、温度、降水量等环境因子极显著影响次生代谢物含量。磷和钾有助于黄酮的形成，荞麦上，过量施用氮肥会降低荞麦类黄酮含量，磷肥和有机肥提高荞麦类黄酮含量[19]；在大豆上研究结果表明，过量施用氮肥降低异黄酮含量，增施磷肥提高异黄酮含量[20]；枸杞中黄酮含量与速效钾呈正相关[21]。非正常温度、降水等气候条件对黄酮的形成亦有影响，大豆荚果发育时低温有利于异黄酮含量形成[9，22-23]。葡萄在成熟期干旱条件下，有利于黄酮积累，在果实成熟过程中，干旱使得黄酮合成过程中CHS、CHI、F3′5′H、F3H、FLS基因上调[24]。这可能与次生代谢物的抗胁迫功能有关。本研究结果表明，2011，2012年安徽合肥试验点 TFC极显著高于其他试验地，2011年安徽合肥试验点TPC极显著高于其他试验点。今后试验中应详细记录降水、温度等气象资料，测定试验地土质和各种矿物质含量等土壤数据，以研究营养元素及成熟期水量和温度对籽仁中 TFC、TPC 的影响模式及机理。

不仅是黄酮和多酚二次生代谢物含量受土质、气象等环境影响，脂肪和糖2个初生代谢物亦受外界环境影响。花生苗期、荚果生长期干旱降低籽仁含油量，壤土和沙土比黏土有利于花生种子中糖的形成。日照时数是影响花生中脂肪含量的主要气象因子，即与纬度相关[25]。黄酮和多酚均属于苯丙烷代谢途径产生的次生代谢物，与初生代谢物脂肪共同争夺糖代谢的同一中间产物-丙酮酸，黄酮和多酚含量理论上推测与脂肪含量呈负相关关系，与糖呈正相关关系。外界环境如施肥、水量等因子变化时，初生代谢物和次生代谢物之间的关系与理论推测有异。速效钾肥不仅能促进枸杞中黄酮的形成，也能提高果实中多糖含量，全盐对枸杞中甜菜碱和维生素 C 的形成有促进作用，与总糖含量也呈正相关[21]。不同时期增施钾肥能同时提高红富士苹果的可溶性糖和维生素 C 的含量[26]。但也有研究结果表明，一定的氮肥水平下，枸杞中黄酮含量与多糖、胡萝卜素含量呈负相关，与总糖正相关，但超过一定的氮肥水平，各代谢物的变化趋势不同[27]。本研究 2011 年结果符合理论推测，2012 年就完全不符，另外，在分析影响黄酮、多酚的因子中，涉及年份的效应值是最大的，推测降水、温度是影响贮藏代谢物比例变化关系的重要因子。

致谢：感谢国家花生产业技术体系安徽合肥实验站、江苏徐州实验站、河南濮阳实验站、山东潍坊实验站和河北保定实验站提供试验用材料。

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(North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources Laboratory of Education Ministry，Key Laboratory of Crop Germplasm Resources Laboratory of Hebei，College of Agronomy,Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China)

Abstract：In order to explore the ecological environment impact on peanut seed flavonoids and polyphenols，and the correlation between their changes with changes of fat and total sugar content，16 widely cultivated peanut varieties which were significantly different in flavonoid and polyphenol content，were planted in several test locations for two years. Total flavonoids content，total polyphenols content，fat content and total sugar content of peanut seeds were evaluated. The results showed that the genotype effect significantly affected the content of flavonoids and polyphenols in peanut seeds.Puhua 23 was a high TFC variety and Yuhua 9327 was a high TPC variety. The effects of ecological environment on the content of flavonoids and polyphenols were significant，and Hefei was the most suitable planting areas for forming flavonoid and polyphenol. The effect of temperature and precipitation was also significant. In addition，the corresponding trend between the secondary metabolites (flavonoids and polyphenols)and primary metabolites (fat, soluble protein and total sugar) among the locations were different between two years.

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-14)；河北省科技支撑计划项目(16226301D)

作者简介：侯名语(1976-)，女，河北保定人，实验师，在读博士，主要从事花生种质资源研究与利用。

通讯作者：刘立峰(1968-)，男，河北宁晋人，教授，博士，主要从事花生遗传育种研究。