设施菜地兴起于20世纪80年代，其生产弥补了露地生产受季节性影响的缺点，解决了蔬菜季节供应与消费者持续需求的矛盾，在蔬菜生产中占相当大的比重[1]。然而，设施大棚常年处于封闭环境，具有水肥施用量大、无雨水淋洗、作物连作、温度高等特点，在其连续使用一定年限后，会使土壤质量下降、微生物群落减少、甚至污染地下水[2-4]。土壤质量的下降使蔬菜作物品质下降、产量降低，这已成为限制设施菜地发展的重要问题。因此，如何缓解土壤资源压力，提升土壤质量是现今土壤科学的主要研究内容[5-6]。
土壤质量不仅影响农业的可持续发展，还对植物营养和人类健康有直接的影响。土壤化学、物理和生物学的指标反映着土壤质量的变化[7]。土壤酶参与土壤的物质代谢和能量循环过程，是土壤生物化学性质的重要组成部分，是评价土壤生物活性和土壤肥力的重要指标[8-11]。土壤酶主要来自于动植物或微生物的活体或遗体，通过催化土壤的生物化学反应来发挥作用，反映某种生物反应过程的强弱[12]。Doran [13]认为，土壤酶对因外界环境或管理因素引起的变化较敏感；吴凤芝、田永强等[14-15]将蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和过氧化物酶等初步确定为设施蔬菜敏感的土壤酶学指标。不仅如此，研究者还发现，土壤酶具有“时效性”，土壤酶活性的动态变化可更好地评价土壤质量的演变[16-17]。
目前对土壤酶活性的研究多集中于大田作物。设施蔬菜，尤其是长期定位不同施肥处理对设施菜地土壤酶活性影响的研究相对较少，且这些动态变化着的土壤酶活性与土壤养分的相关性也鲜有报道。基于此，本研究以寿光市试验年限12年的设施番茄土壤为研究对象，探讨长期定位不同施肥条件下，土壤酶活性的时空变化及其与土壤养分的相互关系，探究不同酶在土壤肥力演变中的作用，为作物的持续高产及培肥土壤提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 供试材料
供试土壤采自于山东省寿光市，长期不同施肥定位试验开始于2004年8月。寿光市为半湿润气候，年平均气温12.4 ℃。试验土壤是pH值7.5的潮土。试验初期大棚0～20 cm土壤理化性质分别为有机质18.3 g/kg；全氮1.37 g/kg；碱解氮112 mg/kg；速效磷437 mg/kg；速效钾299 mg/kg；EC值251 μs/cm。
供试作物为番茄(Lycopersicum esculentum Mill)。设施番茄1年种植2次，即冬春季(WS)和秋冬季(AW)。冬春季，番茄幼苗2月中旬移植，6月中旬收获；秋冬季，幼苗移植在8月初，收获在第2年的1月。每个培养季，沟灌次数约9～11次，灌溉时间以及灌溉体积由番茄的生长期需求决定。
试验设置4个不同的施肥处理，每个处理3个随机区组 (1.6 × 1.2 m2)。除空白处理CK(作物各生长期均不施用任何肥料)外，其余3个处理均以10 t/hm2风干鸡粪作为基肥，然后根据作物生长期，不同处理施以不同量的肥料(表1)。冬春季在第2，3，4穗果时追施尿素，秋冬季在第3，4，5穗果时追施尿素。
表1 不同处理施肥量
Tab.1 Fertilizer amount of different treatments
基肥Base manure追肥(每次用量)Top application(Amount of fertilizer per time)风干鸡粪/(t/hm2)Chicken manure小麦秸秆/(t/hm2)Wheat stalk尿素/(kg/hm2)UreaK2SO4(kg/hm2)CK00020鸡粪+秸秆M+S108020鸡粪+尿素,常规施肥M+U10012020鸡粪+尿素+秸秆M+U+S10812020
1.2 样品的采集与分析
试验样品采集于2015年设施番茄的秋冬季，分4次取样，分别为定植前(8月)、初果期(9月)、盛果期(11月)和拉秧期(1月)，均为0～20 cm耕层土壤。土样采用四分法，一部分立刻过2 mm筛，用以测定土壤酶活性；另一部分风干后过1 mm筛，以测定土壤理化性质。
土壤蔗糖酶活性、纤维素酶活性均采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定[18]，酶活性以24 h后1 g干土生成葡萄糖微克数表示。脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定[18]，酶活性以24 h后1 g土壤中NH3-N的毫克数表示。酸性磷酸酶活性以磷酸苯二钠比色法测定[18]，酶活性以24 h后1 g土壤中释放酚的毫克数表示。过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法测定[18]，酶活性以1 h后1 g土壤消耗0.1 mol/L高锰酸钾毫升数表示[18]。
土壤基本理化性状采用常规分析法测定[18]。
所有数据均为3个重复9个平行样本的平均值，结果采用SPSS软件进行统计分析。LSD法比较平均数间的差异显著程度，相关性分析采用Pearson分析法。
2 结果与分析
2.1 不同生长期土壤酶活性和土壤养分的动态变化
从图1可以看出，土壤酶活性随番茄生长期的不同呈现明显不同的变化趋势。其中，蔗糖酶和纤维素酶的动态变化趋势基本一致，均为先升高后降低，酶活性高峰出现在初果期(图1-A、B)。脲酶能酶促土壤中的尿素产生氨，该酶促反应是土壤中氮的主要来源之一；酸性磷酸酶能水解土壤中的有机磷化合物，生成作物可利用的无机磷。从图1-C、D可以看出，脲酶和酸性磷酸酶活性最高峰均出现在番茄生长的盛果期。过氧化氢酶能分解土壤中的有害物质-过氧化氢，对于土壤中的微生物和作物有一定的保护作用[19]。从图1-E结果来看，过氧化氢酶活性随番茄生长呈现降低趋势。
图1 长期施肥对土壤酶活性的影响
Fig. 1 Effects of long-term fertilization on soil enzyme activities
番茄生长期土壤养分变化规律呈现先升高后降低的趋势，有机质含量在拉秧期最高，其余土壤养分含量峰值在盛果期。从施肥试验设计(表1)来看，由于初果期后会向土壤中的施入氮肥，使得土壤中的养分含量逐渐升高，到盛果期施肥量降低，加之植株生长需要大量吸收土壤中的营养物质，使得养分含量逐步下降，这与任祖淦等[20]的研究结果一致；而盛果期后大量落叶在土壤中被微生物分解，使得拉秧期土壤中有机质的含量，显著高于其余3个时期。
2.2 长期施肥对土壤酶活性的影响
从图1可以看出，长期不同施肥处理条件下土壤酶活性存在差异。相较于传统施肥M+U，增施秸秆的M+U+S处理在番茄生长的各时期酶活性除过氧化氢酶盛果期外均显著升高，蔗糖酶、纤维素酶、脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶酶活性增幅分别为13.95～17.93，79.35～103.56，11.50～15.73，4.30～8.00，0.45～0.89个酶活单位。
图1-A、B的研究结果表明，长期定位施肥条件下，蔗糖酶和纤维素酶的酶活性高低顺序为M+U+S >M+S >M+U >CK。M+S处理条件下，番茄生长各时期蔗糖酶和纤维素酶活性显著高于M+U及CK处理；2种酶活性在M+U处理条件下又显著高于CK处理。此外，王树起等[21]的研究结果表明，有机肥的施入可引入一定的外源蔗糖酶及纤维素酶，增加土壤有机碳的输入量，为蔗糖酶及纤维素酶提供更多的酶促基质，大大提高2种酶活性。
从图1-C看来，本试验田在长期定位施肥处理条件下，土壤脲酶活性为0.49～16.54。与CK相比，M+U脲酶活性显著降低了3.38～5.53个酶活单位，而M+S处理显著提高了5.65～8.96个酶活单位，M+U+S处理显著提高了6.77～9.69个酶活单位。从各施肥处理的碳氮比(C/N)分析，由于M+U、M+U+S、M+S的C/N分别为18，33 和44(以上结果基于小麦秸秆碳含量40%，尿素氮含量46%，鸡粪碳氮含量分别为40%和1.63%计算得来)，M+U处理条件下脲酶活性的显著降低，充分说明过量施入氮肥对脲酶活性有一定的抑制作用。化肥配施有机肥，尤其是调配比例合适使其C/N在25～35∶1时(如M+U+S处理)，最能有效促进微生物活动，产生葡萄糖或其他的有机物质，提高土壤脲酶活性，这与孙瑞莲等[22]基本一致。
从图1-D可以看来，相较于CK，M+U处理中的酸性磷酸酶活性提高不显著；而M+S处理和M+U+S处理均显著提高了酸性磷酸酶活性，提高幅度分别为185.27%～516.71%和420.00%～698.86%。M+S处理和M+U+S处理均显著提高了土壤磷酸酶活性则进一步说明，腐解的或正在腐解的有机肥，为微生物生长提供能源和营养物质，是土壤酶的优良基质，有利于土壤酶活性的提高[23]。
由图1-E可以看出，长期定位施肥处理条件下试验田土壤过氧化氢酶活性为1.24～4.07。相较于CK处理，M+U处理过氧化氢酶活性降低了0.24～0.38个酶活单位，这说明长期施肥显著减少了土壤中好氧微生物的数量，降低了土壤氧化作用，抑制了过氧化氢的分解，这与徐福利等[24]的研究结果基本一致。
2.3 长期施肥对土壤养分动态变化的影响
长期不同施肥显著影响土壤养分含量。与CK相比，施肥显著提高了土壤有机质、碱解氮、速效磷、钾及全氮含量(表2)。与单施有机物料(M+S)相比，在有机物料的基础上增施化肥显著提高了土壤养分含量，有机质、碱解氮、速效磷、速效钾及全氮增幅分别为22.12%～30.90%，12.78%～19.95%，21.84%～30.52%，18.41%～47.36%，79.10%～87.54%；施用高碳氮比秸秆显著提高土壤养分含量，M+U+S处理上述各含量比M+U处理显著增加8.92%～40.71%，9.54%～18.52%，23.65%～27. 87%，13.53%～58.81%，13.20%～18.25%。
表2 长期施肥处理下土壤的主要理化性质
Tab.2 Soil physicochemical characteristics under long-term fertilization treatment
处理Treatment土壤全氮量/(g/kg)Total N有机质/(g/kg)Organic matter速效磷/(mg/kg)Available P速效钾/(mg/kg)Available K碱解氮/(mg/kg)Available N定植前CK0.76±0.13d12.98±0.27d35.73±1.10d145.35±1.03c204.49±5.36dBefore plantingM+S1.22±0.08c20.50±0.16b68.30±1.41c163.18±3.29b228.41±2.34cM+U2.01±0.06b19.10±0.52c66.77±3.44b166.11±3.53b231.23±2.61bM+U+S2.28±0.02a26.83±0.14a83.18±2.82a193.27±3.38a274.04±3.72a初果期CK0.83±0.18d14.65±0.30c36.90±2.24c152.69±4.81c227.31±6.34dFirst-fruit stageM+S1.32±0.09c21.71±1.10b74.16±4.81b274.95±4.64b240.92±1.20cM+U2.03±0.06b19.93±1.20b75.35±4.65b273.01±3.23b250.74±1.75bM+U+S2.40±0.12a28.05±0.91a93.12±4.44a395.42±4.07a282.54±1.84a盛果期CK0.80±0.07d15.98±0.87c53.47±4.43c155.69±4.02c230.31±1.30dFull-fruit stageM+S1.39±0.10c21.11±0.84b82.77±3.32b440.68±85.85b251.26±1.05bM+U2.12±0.09b20.80±1.16b81.68±1.15b490.25±49.57b254.38±4.64cM+U+S2.49±0.04a26.71±0.87a104.45±2.45a556.34±57.24a283.54±1.11a拉秧期CK0.76±0.04d27.93±2.16d36.80±1.55c110.23±28.62c224.64±1.35cFruit-harvest stageM+S1.27±0.03c37.16±0.44c72.39±3.61b270.29±2.20b240.71±6.62bM+U2.05±0.04b41.63±0.74b74.02±1.40b250.68±2.69b247.59±2.13bM+U+S2.39±0.04a45.37±2.26a94.45±2.50a398.08±1.99a271.20±6.04a
注：同一列中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。表3同。
Note：Different lowercases in each column mean significant differences at P<0.05 level. The same as Tab.3.
长期不同施肥处理后，土壤pH值变化明显(表3)。与CK处理相比，单施有机物料处理pH值降低；在施用有机物料的基础上增施化肥使pH值进一步降低至6.64～6.67，与CK相比降低约0.86个单位；在传统处理的基础上施用秸秆有利于缓解土壤pH值的下降，M+U+S处理pH值较M+U处理显著提高0.35～0.36个单位。大量施用化肥之后进行漫灌，土壤中的钾、钙、钠、镁等碱基盐分离子淋洗到了土壤深层，使土壤氢离子增多，pH值下降；而秸秆增施后，由于其可在土壤中腐解，提高土壤中有机质的含量，增强土壤对酸的抵抗能力，又可减少水分淋洗，有效抑制土壤酸化的进程[25]。同时，无论何种施肥处理，土壤pH值均处于作物可正常生长的范围，只要防止土壤的进一步酸化，仍适合蔬菜的生长。
土壤EC值反映土壤盐分含量。在本研究中，与CK处理相比，长期不同施肥处理设施番茄土壤EC值均显著提高。其中，与单施有机物料相比，有机物料配施化肥使EC值增加38.71～56.74 μs/cm，增幅为14.82%～25.05%；而在常规施肥的基础上增施秸秆则使土壤EC值显著降低了45.01～59.38 μs/cm，降幅为15.26%～18.60%。土壤EC值的变化说明，由于设施蔬菜每年施入的氮磷钾肥量较大，约为作物正常生长所需肥量的6～8倍，未被吸收的矿质营养元素，除淋溶损失外，大部分仍留存在表层土壤中，使土壤EC值明显升高，次生盐渍化逐渐加重；而秸秆的施入有效降低了土壤水分的蒸发，抑制了盐分的聚集，降低了盐离子浓度，对缓解日光温室土壤次生盐渍化效果明显[26]。
表3 长期施肥处理下土壤的pH及EC值
Tab.3 Soil pH and EC under long-term fertilization treatment
处理TreatmentpHEC/(μs/cm)定植前CK7.43±0.021a170.00±2.00dBefore plantingM+S7.10±0.038b226.67±3.06cM+U6.65±0.012d329.33±15.14aM+U+S7.00±0.015c283.33±3.06b初果期CK7.45±0.040a172.67±6.66dFirst-fruit stageM+S7.24±0.036b246.00±2.00cM+U6.66±0.046d341.33±17.47aM+U+S7.09±0.310c296.33±5.51b盛果期CK7.38±0.055a196.00±3.00dFull-fruit stageM+S7.19±0.021b274.00±4.36cM+U6.64±0.049d378.67±9.02aM+U+S7.05±0.125c319.33±6.43b拉秧期CK7.37±0.023a177.33±8.62dFruit-harvest stageM+S7.16±0.029b261.67±7.77cM+U6.67±0.015d353.67±17.79aM+U+S7.03±0.021c300.33±8.15b
2.4 土壤养分和土壤酶活性的相关分析
虽然很多研究表明酶活性之间有一定内在联系，但结果却因土壤类型、气候类型、肥料种类、用量的不同而不同。本试验中土壤酶活性之间的相关性分析(表4)表明，除酸性磷酸酶外，脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、纤维素酶之间均极显著正相关，这说明土壤中氨的转化、氧化还原、多糖分解等过程密切相关，即这些酶之间具有一些共性。这些相互影响、具有共性的所有酶在一定程度上反映土壤的肥力水平，因此，在探究土壤酶对土壤肥力的影响时，综合多种酶活力是很有必要的。
表4 土壤酶活性之间的相关性分析
Tab.4 Correlation coefficients among soil enzyme activities
变量Variable蔗糖酶Sucrase纤维素酶Cellulase脲酶Urease酸性磷酸酶Acid phosphatase过氧化氢酶Hydrogen peroxidase蔗糖酶Sucrase1.000纤维素酶Cellulase0.996**1.000脲酶Urease0.932**0.924**1.000酸性磷酸酶Acid phosphatase0.2680.2790.1441.000过氧化氢酶Hydrogen peroxi-dase0.938**0.939**0.987**0.1611.000
注：r0.05=0.553，r0.01=0.684，n=12；*，**.显著和极显著相关。表5同。
Note：r0.05=0.553，r0.01=0.684，n=12；*，**.Significant difference at 5%and 1% levels， respectively.The same as Tab.5.
土壤酶活性与土壤养分之间的相关分析结果(表5)表明，酸性磷酸酶、纤维素酶、蔗糖酶活性与全氮、有机质、速效钾、速效磷、碱解氮有极显著的正相关关系；脲酶参与氨的转化，与全氮含量及碱解氮含量相关性极显著。土壤pH值及EC与各土壤酶活性相关性不大。过氧化氢酶活性与土壤各养分离子相关性不高，这说明过氧化氢酶对应的土壤的氧化还原过程，与土壤养分含量关系不密切，而其余过程，如氨的转化、有机磷的转化、多糖的分解过程，与土壤养分的动态变化密切相关。因此具有“时效性”的土壤酶活性，对评价土壤肥力的动态变化更为有效[27]。
表5 土壤酶活性与土壤养分含量之间的相关分析
Tab.5 The correlative coefficients between soil enzymatic activities and soil nutrient contents
变量Variable蔗糖酶Sucrase纤维素酶Cellulase脲酶Urease酸性磷酸酶Acid phosphatase过氧化氢酶Hydrogen peroxidase全氮 Total N0.876**0.871**0.975**0.971**0.022有机质 Organic matter0.852**0.859**0.2890.729**0.265速效磷 Available P0.964**0.966**0.5240.893**0.503速效钾 Available K0.821**0.822**0.2230.698**0.199碱解氮 Available N0.974**0.975**0.699**0.952**0.482pH-0.245-0.2570.472-0.310.494EC0.5260.535-0.2000.334-0.224
3 讨论与结论
土壤酶活性及土壤养分含量随生长期不同呈现动态变化。番茄初果期营养生长和生殖生长同时进行，花芽分化需大量易溶性碳源供应，而蔗糖酶的作用产物为易溶性小分子糖类(葡萄糖和果糖)，纤维素酶促进了纤维素的分解利用，增加了碳素供应，二者在番茄生长的初果期酶活性最高，符合番茄生长需求，这与杨东等[28]的研究结果一致。番茄盛果期根系生长及果实膨大等需要大量的养分供应，因此根系分泌较多的脲酶及酸性磷酸酶，以促进土壤中氨及速效磷的转化。另外氮素是叶绿素的组成部分，盛果期旺盛的光合作用需要大量氮素来满足代谢需要；磷素参与细胞核和细胞质的组成，番茄对磷素最敏感，生殖生长中缺磷严重影响作物产量和品质，因此，盛果期土壤中2种酶活性最高[29-30]。张玉等[31]的研究结果表明，冬春节番茄在生长过程中环境温度逐渐降低，或者灌溉次数增加，使好氧微生物活性逐渐降低，这可能是导致过氧化氢酶活性随生长期逐渐降低的原因。
施用秸秆对于土壤酶活性及土壤养分含量有提高作用。叶协锋等[32]的研究结果发现秸秆的施入有效提高了土壤酶活性，秸秆在施入过程中会带入土壤一部分微生物，秸秆分解又为土壤提供了碳源和氮源，给微生物活动提供了能量，促进了其大量繁殖，微生物的持续活动又产生了大量的土壤酶。在本次研究过程中，秸秆施用显著提高了土壤养分含量，增加了土壤酶活性，这与前人的研究结果一致。
在本次试验中，施用化肥提高了土壤养分含量，增加了土壤蔗糖酶、纤维素酶及酸性磷酸酶活性。陈桂芬等[33]的研究结果表明，氮素促进番茄茎叶生长，叶色增绿，有利于蛋白质的合成，施用尿素后，植物吸收氮素转变为蛋白质，这一过程需要消耗大量糖类，糖代谢的旺盛刺激了蔗糖酶和纤维素酶活性的升高，使得M+U+S 处理条件下蔗糖酶和纤维素酶活性显著高于M+S处理。张伟等[16]的研究表明，施用尿素可以增加土壤中的核酸酶活性，而核酸酶降解产物无机磷则会抑制磷酸酶活性，这在一定程度上解释了M+U和CK处理条件下酸性磷酸酶活性变化不大的原因。但本试验化肥的施用抑制了脲酶活性，这与彭小兰等[34]的研究结果不一致，可能是氮肥施用量的差异或供试作物的不同等因素造成的。
有机肥的施用给土壤带来了大量的外源酶类及微生物，不仅微生物的活动产生了能量，有机肥本身腐熟产生大量的能量物质，为微生物活动提供了保障，极大地提高了土壤酶活性，因此，本试验中施用了有机肥的处理土壤养分含量及土壤酶活性均高于空白处理土壤，这与邱现奎等[35]研究结果一致。
随着番茄生长的进行，土壤养分及土壤酶活性呈现动态变化。纤维素酶和蔗糖酶在初果期时酶活性最高；土壤全氮、速效磷、速效钾、碱解氮含量及土壤脲酶、酸性磷酸酶活性最高值均出现在盛果期；拉秧期时土壤有机质含量最高。
增施高碳氮比作物秸秆有利于降低土壤次生盐渍化水平，缓解土壤pH值的下降。在本试验中，M+U+S处理对提高土壤养分含量及土壤脲酶、酸性磷酸酶、纤维素酶和蔗糖酶活性最为有效。
与CK处理相比，尿素的长期大量施入(M+U处理)显著降低了土壤酸碱度，显著提高了土壤中的盐离子浓度，抑制了土壤脲酶和过氧化氢酶的活性，对酸性磷酸酶的提高不显著。
除酸性磷酸酶外，蔗糖酶、纤维素酶、脲酶、过氧化氢酶间均呈极显著正相关性。除过氧化氢酶外，酸性磷酸酶、纤维素酶、蔗糖酶活性与土壤养分含量均有极显著的相关关系，脲酶与全氮及碱解氮含量相关性极显著。土壤酶活性的动态变化可以作为衡量土壤肥力变化的指标。
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