大白菜干烧心病抗性QTL定位研究

大白菜干烧心病是我国近年来大白菜生产上继三大病害之后，危害较为严重的一种病害[1-2]，是不可逆的生理病害之一，会造成严重的经济损失[3-4]。干烧心病经常和病原菌感染一起发生，进一步造成减产和品质下降[5]。干烧心病的成因极其复杂，现在人们普遍认为是由于钙离子的缺失引起的生理性病害[6-9]。此外，由于干烧心病是数量性状，受多基因控制，数量性状在选择中易受环境因素影响，因此成为育种工作的难点[10]。QTL定位与分子标记辅助选择育种显得尤为重要。国内外有关大白菜干烧心病方面的报道主要集中在发病机理[2]、症状表现[11]、栽培防治[12-14]、遗传规律[15]和室内鉴定方法[16-17]等方面的研究，有关大白菜干烧心病QTL定位的研究虽然有一些报道，但目前研究尚少。孙秀峰等[18]首次将大白菜干烧心病的研究深入到分子方面，以F2作为群体，构建了AFLP分子遗传图谱，利用 MAPQTL 4.0 软件检测到与抗干烧心病有关的QTL位点共有4个，解释的遗传变异为11%～58.9%。李坤等[19]以F2群体为材料，利用SSR、SRAP分子标记，对大白菜干烧心病性状相关的QTL与相应的连锁关系进行分析，获得2个与干烧心病性状相关的QTL，都位于LG2连锁群上，贡献率分别为7.8%和16.5% 。黄萍等[20]报道了1个与大白菜干烧心病基因紧密连锁的AFLP标记( E10/ M05)，E10/M05与大白菜干烧心病感病性状是相连锁的，此标记与干烧心病病情级数的相关系数为0.633，达到极显著相关。石姜超[15]报道了2个与大白菜干烧心病基因连锁的SRAP分子标记，遗传距离分别为6.5，5.8 cM。对大白菜干烧心病性状进行QTL定位，以期利用与QTL紧密连锁的分子标记进行大白菜资源干烧心病抗性的辅助选择。

1 材料和方法

1.1 永久群体和图谱的构建

本研究材料黑227为青麻叶类型大白菜高代自交系，抗干烧心病；包头型高代自交系B120，感干烧心病，由天津科润蔬菜研究所提供。以黑227为父本、B120为母本配制杂交一代，通过游离小孢子培养的方法构建了含99个株系的DH群体为永久作图群体。以该群体为试材已绘制完成一张大白菜遗传图谱。该图谱含有108个标记位点(其中34个SSR标记，74个InDel标记)，全长1 004.7 cM，平均图距9.30 cM，包含12个连锁群，其中可与大白菜9条染色体一一对应[21]。

1.2 试验设计

试验分别在2015年春季和2016年春季进行，2015年播种日期为1月29日，定植日期为3月5日，调查日期为5月7日；2016年播种日期为2月14日，定植日期为3月15日，调查日期为5月17日。试材种植在天津市宝坻区农业局农场日光温室中，各株系调查株数均为5株。种植密度为：行距50 cm，株距40 cm。常规栽培管理。

1.3 大白菜干烧心病的田间鉴定

春季在日光温室进行DH群体的种植，根据田间干烧心病发病程度对每个株系进行病害分级，群体病情分级标准如表1所示，抗性归类标准如表2所示，病情指数(DI) =∑(每个病级的植株总数×所归类的级别数)/(植株总数×最高级别数)×100。将病情指数进行整理，用SPSS软件对2年的结果进行统计，计算遗传参数并绘制频数分布直方图。

1.4 大白菜干烧心病QTL定位

采用MapQTL 5.0进行QTL分析，首先使用置换测验做1 000次重复，用于估算大白菜基因组范围内α=0.05水平上的LOD阈值。本研究中2015年使用的LOD阈值为7.7，2016年使用的LOD阈值为2.8。然后利用区间作图法进行QTL分析，在每条染色体上每间隔1 cM的位置对QTL存在的可能性进行1次扫描。对于检测到的QTL位点，将最高的LOD值所在位置的分子标记或与其紧密连锁的分子标记作为协同因子，再对这些QTL位点进行多座位QTL模型检测，将LOD值最高的位置作为本试验QTL的位置，以2-LOD所在的区间作为95%的置信区间。QTL的命名规则为：干烧心性状的英文缩写+连锁群号+QTL编号。

使用复合区间作图法在大白菜全基因组范围内进行QTL扫描，用似然比LR大于11.5，即LOD值大于2.5来判断QTL存在的阈值。

1.5 QTL 定位区域的序列分析

使用NCBI中的Blast 功能将检测到的QTL 定位区域序列同大白菜全基因组序列进行比较，利用提供的基因注释功能对QTL 定位区域中的所有候选基因进行分析。

2 结果与分析

2.1 大白菜干烧心病的抗性鉴定结果与遗传分析

对本试验中2015，2016年的亲本、F1以及DH群体的抗病性进行调查，统计与分析的结果如表3所示。2015，2016年黑227的DI均为0，表现为高抗，B120 的 DI 分别为 82.14和85.71，表现为高感，F1的 DI 分别为16.67和15.43，介于2个亲本之间，并且趋于抗病。根据2个年度大白菜DH群体鉴定得到的DI结果，绘制频数分布直方图(图 1，2)。结果表明，本研究中所用DH群体2015年的DI结果不符合正态分布，而2016年该群体的DI结果服从正态分布，属于数量性状遗传，该群体可以用于QTL分析。

2.2 大白菜干烧心病抗性基因的 QTL 定位

利用MapQTL 5.0软件进行QTL分析，2015，2016年连续2年的数据，对大白菜DH群体进行QTL定位，发现检测到的QTL位点一致，可以认为是相同的 QTL，因此给予了相同的命名tb7.1，2次结果的遗传贡献率均大于10%，为主效QTL，该QTL位于 Chr.7上(图3)，其中BrID10343为共分离标记，BrID10349为紧密连锁标记，加性效应均为正值。

根据 2015年干烧心病抗性鉴定结果，tb7.1位于标记BrID10343和BrID10349之间，距离两侧标记的遗传距离分别为6.9，5.0 cM，2个标记的LOD 值分别为9.91，9.72，遗传贡献率分别为41.5%，41.1%，tb7.1为增效位点，加性效应为正值。根据 2016年干烧心病抗性鉴定结果，2个标记的LOD 值分别为4.46，4.10，遗传贡献率分别为19.6%，18.2% (表4)。

2.3 干烧心病抗性基因所在区域的生物信息学分析

利用BRAD (http：// brassicadb.org/brad/index.php)的BlastP工具获得与大白菜中相对应的拟南芥中的同源基因及基因注释功能，对大白菜干烧心病抗性基因QTL所在区域进行了序列分析，发现标记BrID10343和BrID10349间的物理距离为903.61 kb，在这两标记区间共有202个候选基因(图3)。这些候选基因主要分为以下几类：锌指结构、转运蛋白、酶类、转录因子以及3个 NBS 抗病基因(Bra016029、Bra016028、Bra016027)(表5)，这些抗病候选基因是下一步工作的研究重点。

3 讨论

3.1 关于2015，2016年DH群体的参数分析

根据2015，2016年的数据，通过计算偏度g1和峰度g2及其标准误σg1及σg2然后作U检验。U检验公式为和。根据2015年的数据，0.116/0.343<1.96，1.464/0.674>1.96，该组资料不服从正态分布。根据2016年的数据，0.717/0.386<1.96，0.064/0.411<1.96，2种检验同时得出U0.05=1.96，即P>0.05的结论，可以认为该组资料服从正态分布。

3.2 关于2015，2016年DH群体干烧心病病情指数分布的差异

2年的病情指数分布存在差异，可能有以下几个原因：①群体2年所处的自然环境存在差异，包括光照、水分、温度、湿度等，导致发病程度不一。②由于土地面积原因，每种材料种植的数量较少，应尽可能扩大样本容量，减少引起的抽样误差。③对于抗性鉴定的分级，受到笔者经验的影响，存在主观因素。但2年均定位到同一位点，并且LOD远远大于2.5，说明定位结果的可靠性。

3.3 关于大白菜干烧心病的分子标记

由于大白菜干烧心病的鉴定易受环境因素的影响，比较费时费力，研究者们主要利用MAS 育种选择抗病品种，以提高育种效率。然而，目前与大白菜干烧心病抗性基因紧密连锁的分子标记报道较少，且大多为 SRAP和AFLP标记，由于这些标记的连锁距离不够紧密，加上 SRAP 和AFLP技术的局限性，导致前人研究结果对于MAS育种的应用性不强。

本研究首次利用InDel标记对大白菜干烧心性状进行了定位，相较于孙秀峰等[22]和黄萍等[20]利用的AFLP标记，李坤等[19]和石姜超等[11]利用的SRAP标记、InDel标记具有许多优点，它广泛存在于基因组中，并且稳定性高，重复性好，易于操作，多态性水平高[23]。InDel标记的开发，对基因精细定位的研究和分子标记辅助育种具有重要的价值。

3.4 关于大白菜干烧心病抗性基因的QTL定位

目前，大白菜干烧心QTL的定位只是在各自构建的连锁群上，没有实现与染色体的对应，彼此之间的 QTL 也很难进行比较分析。本研究首次利用DH群体将大白菜干烧心病抗性QTL 定位到了大白菜染色体上。笔者尝试将本研究QTL 定位的结果与前人的结果进行对比分析，但由于没有发现共用的分子标记，所以无法进行比较。

QTL定位是采用田间试验与分子标记分析相结合的方法进行的，因此它是连接作物遗传和育种的纽带。与大白菜干烧心基因紧密连锁的分子标记的开发为大白菜主要经济性状分子标记辅助选择提供了理论基础。

3.5 关于大白菜干烧心病抗性基因主效 QTL 的生物信息学分析

在大白菜干烧心病抗性基因主效QTL所在区域预测到了3个抗病基因 Bra016029、Bra016028、Bra016027，这些基因将是今后研究的重点。

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