红麻液泡膜质子泵H+-PPase(Hcvp1)基因的克隆、序列分析和表达

土壤的盐碱化是一个世界性的难题，全球盐渍土面积约10亿hm2，中国盐渍土面积约占世界盐渍土面积的10%[1-3]。随着人类活动的增加，环境的恶化，不合理的灌溉等因素使盐碱化土地的面积不断扩大。随着世界人口的不断增加，对粮食的需求也不断增加[4-5]，人口、粮食、耕地的矛盾不断加剧，所以探索农作物的耐盐机理，培育耐盐品种是一项十分重要的任务。

植物在进化过程中形成了各种生理生化机制来适应盐胁迫，其中盐离子的转运和吸收是一个很重要的耐盐机制。液泡是成熟植物细胞中最大的细胞器，在细胞渗透压的调节、离子的吸收和转运、有毒离子的区域化以及信号转导系统的调控等方面具有重要作用[6-7]，而液泡膜上的质子泵是实现这些生物功能的关键因素。定位于液泡膜上的H+-PPase的质子泵，能够利用焦磷酸(PPi)为底物，催化H+由细胞质进入液泡，形成电化学梯度，用于各种离子的运输和积累，维持细胞的离子平衡和渗透压，保证植物能够在盐胁迫下正常生长[8-9]。H+-PPase基因已经从多种植物中得到了克隆，如黄瓜、玉米、梭梭、陆地棉、费尔干猪毛菜、刚毛柽柳等[10-15]。大量的研究表明，通过对H+-PPase基因的遗传转化能够显著提高转基因作物的耐盐性。Gaxiola等[16]在2001年首次将AVP1 基因转入拟南芥中，结果发现，超表达AVP1 基因的转基因植株抗盐性得到增强。Duan等[17]通过在烟草中过量表达液泡膜H+-PPase基因，发现在盐胁迫下转基因烟草比野生型烟草叶肉细胞液泡中的Na+含量更高，耐盐性更强。

红麻(Hibiscus cannabinus)是一年生韧皮纤维作物。红麻纤维是重要的纺织原料，可以用于地毯，麻袋的生产，随着红麻多用途开发利用的研究，红麻还可以用于建筑板材、纸浆、饲料、麻骨炭等方面[18]。随着人们对粮食需求的不断增加，红麻的生产必须向盐碱地、滩涂、干旱坡地转移而避免与粮棉油争地。所以对红麻耐盐机理的探索，培育红麻耐盐品种对红麻产业的发展具有重要意义。目前，红麻的H+-PPase基因还未见报道，本研究从红麻耐盐转录组测序结果中发现了该基因，克隆了其全长cDNA序列，并对该基因进行了盐胁迫表达分析，这将为红麻耐盐分子设计育种奠定坚实的基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料和试剂

中红麻16号的种子由中国农业科学院麻类研究所红麻育种课题组提供。选取籽粒饱满，大小均匀的种子，消毒，播种在发芽盒，置于光照培养箱，昼夜温度为28，26 ℃，光照13 h/d，培养7 d后，选取植株健壮，长势一致的红麻幼苗，移入1/2 Hoagland 营养液中继续培养，每天更换营养液。在营养液中培养5 d后进行NaCl胁迫处理，NaCl浓度梯度为0，75，150，250 mmol/L。每个处理设置3个重复，每个重复选用10株幼苗。NaCl胁迫处理5 d后取样，每个处理选取3株幼苗叶片，液氮速冻后保存在-80 ℃冰箱，用于总RNA的提取。

TRIzol购自Invitrogen 公司， Reverse Transcriptase、Rever Transcriptase inhibitor、Power2(SYBR Real-time PCR Premixture、pMD19-T载体购自TaKaRa 公司，DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2 引物设计

依据红麻转录组序列利用Primer premier 5.0进行引物设计，NCBI Blast验证引物准确性，序列由上海生工合成。基因克隆的引物序列：Primer-F(5′-3′)：ATGTCGGATCATGGATTTA；Primer-R(5′-3′)：

TCATGGTTCGTGTTTAAGGA。

1.3 总RNA的提取

参照天根生化科技有限公司，植物总RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA，然后用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的完整性和纯度。

1.4 Hcvp1基因的克隆

提取250 mmol/L NaCl胁迫下红麻幼苗叶片的总RNA，并进行反转录合成首链cDNA，以1 μL反转录产物为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：10×LA PCR Buffer(Mg2+ plus) 2.5 μL，LA Taq(TaKaRa) 0.25 μL， dNTP(2.5 mmol/mL)1 μL，F-primer(10 μmol/mL)0.25 μL，R-Primer(10 μmol/mL)0.25 μL，cDNA 1 μL，dH2O 补足25 μL。PCR反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 3 min，反应终止于4 ℃。反应结束后，取10 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化DH5α感受态细胞，送华大基因进行测序。

1.5 Hcvp1基因的生物信息学分析

利用ORF Finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)寻找Hcvp1基因的最大开放读码框；在NCBI网站((http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对Hcvp1基因的核苷酸序列进行BlastN序列比对，同时利用推测的氨基酸序列进行BlastP比对；利用ClustalW软件进行Hcvp1基因氨基酸序列同源性比对；用MEGA 6.0构建进化树，分析该基因的进化关系。用TMHMM-2.0(http：//www.cbs.dut.dk/services/TMHMM-2.0/)预测Hcvp1基因编码蛋白质的跨膜结构，用(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)推测Hcvp1基因编码蛋白质的等电点和分子量。

1.6 Hvcp1基因在不同NaCl浓度胁迫下的表达特征分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析Hvcp1 在不同的NaCl浓度胁迫下的表达特征。荧光定量PCR的引物Primer-F(5′-3′)：GGTGCGGAGGAATTAGTA，Primer-R(5′-3′)：ATGAAAGCAAATCGTGGT；内参基因为Actin，引物为：Primer-F (5′-3′) CAGGCAGTTCTTTCTTTGT；Primer-R (5′-3′) ATCCTCCAATCCAGACACT。qRT-PCR的反应体系为(10 μL)：Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture 5 μL，正向引物(Forward primer)0.3 μL，反向引物(Reverse primer)0.3 μL，cDNA 2 μL，H2O 2.4 μL。qRT-PCR的反应程序为：95 ℃ 2 min； 95 ℃ 15 s， 61 ℃ 15 s， 72 ℃ 20 s，40个循环。

2 结果与分析

2.1 红麻叶片总RNA的提取

根据天根生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒说明书提取250 mmol/L NaCl浓度胁迫的红麻幼苗叶片的总RNA，然后用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的完整性和纯度。结果如图1所示28S、18S和5S 3条带清晰可见，并且28S条带的亮度约是18S条带亮度的2倍，表明RNA结构完整，无污染和降解可以作为反转录的模板。

2.2 Hcvp1基因的克隆

以红麻耐盐转录组获得的Hcvp1基因的片段序列为基础，设计特异性引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。经PCR获得产物连接到pMD19-T载体上，转化DH5α感受态细胞，经培养后提取质粒，送华大基因公司进行测序。将测序获得的cDNA序列，通过Blast比对发现，其与H+-PPase基因高度相似，将其命名为Hcvp1，在GenBank中的登录号为：KX687919。

2.3 Hcvp1基因的生物信息学分析

经过Sanger测序，该基因cDNA全长2 298 bp，开放阅读框为2 298 bp，推测其编码765个氨基酸的蛋白质(图3)，推测其分子量和等电点分别为80.2 kDa和5.25。用TMHMM-2.0预测表明Hcvp1基因编码蛋白质具有13个跨膜结构(图4)。

将该基因核苷酸序列通过BlastN 比对分析，发现其与雷蒙德氏棉(XM 012587702)、甜橙(XM 006492028 )、毛果杨(XM 006389360 )、烟草(NM001325218)、和大豆(XM 003528254)的H+-PPase基因核苷酸序列的相似性分别为90%，85%，85%，83%，83%，通过BlastP比对发现蛋白质序列的相似性分别为96%，93%，91%，93%，94%。

利用ClustalW软件分析Hcvp1基因氨基酸序列与具有代表性的雷蒙德氏棉(XM 012587702)、甜橙(XM 006492028 )、毛果杨(XM 006389360)、烟草(NM001325218)、红麻(KX687919)和大豆(XM 003528254)的H+-PPase基因氨基酸序列进行比对分析(图5)。结果表明，Hcvp1基因氨基酸序列与其他植物氨基酸序列的一致性为94.6%，保守的氨基酸多达738个，而非保守的氨基酸仅有27个。

利用MEGA 6.0软件分析Hcvp1基因的氨基酸序列与具有代表性的雷蒙德氏棉(XM 012587702)、甜橙(SM 006492028 )、毛果杨(XM 006389360 )、烟草(NM001325218)、红麻(KX687919)和大豆(XM 003528254)的H+-PPase基因氨基酸序列的进化关系(图6)表明，红麻与雷蒙德氏棉的距离最近，这可能是因为两者都是锦葵科的缘故。红麻与毛果杨的距离最远。

2.4 Hvcp1基因在不同NaCl浓度胁迫下的表达特征分析

分别提取0，75，150，250 mmol/L NaCl浓度胁迫下红麻幼苗叶片的总RNA，并反转录成cDNA作为qRT-PCR 反应的模板，以肌动蛋白做内参，进行qRT-PCR 分析，结果如图7所示。表明随着NaCl浓度的增加，Hvcp1基因的表达量不断增加。可见Hvcp1基因与NaCl胁迫直接相关。

3 讨论

根据红麻耐盐转录组测序获得的转录组序列设计引物[19]，从红麻克隆得到Hcvp1基因，采用多种生物信息学的方法对Hcvp1基因进行分析，其cDNA全长为2 298 bp，开放阅读框为2 298 bp，编码765个氨基酸的多肽。同源序列比较发现，红麻的Hcvp1基因序列与雷蒙德氏棉、甜橙、毛果杨、烟草、和大豆的液泡膜H+-PPase 基因的序列高度同源，因此，推测获得的全长cDNA编码产物是红麻液泡膜H+-PPase。

液泡膜H+-PPase在植物耐盐抗旱、生长发育等方面具有重要的作用。液泡膜H+-PPase能够调节液泡的pH值，参与Na+、K+等溶质向液泡内运输；为Na+、Cl-液泡区域化提供运输动力，进而减轻盐害，降低细胞的渗透压[20-21]，提高植物的耐盐能力。本研究通过qRT-PCR分析发现，随着NaCl浓度的提高，Hcvp1基因的表达量也随着升高。可见液泡膜H+-PPase基因的表达受NaCl胁迫的诱导，且表达量与NaCl浓度直接相关，所以液泡膜H+-PPase基因在红麻耐盐机制中具有重要的作用。

本研究克隆了红麻Hcvp1基因，并对其在不同NaCl浓度胁迫下的表达模式进行了qRT-PCR分析，这将为后续开展该基因的功能验证，揭示红麻耐盐机制奠定坚实的基础。

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